Eén flesje, twee doelen: draagbare CRISPR-gebaseerde tuberculosediagnose met 100% gevoeligheid

Een artikel over een draagbare tuberculosetest die direct op sputum kan worden uitgevoerd, zonder complexe apparatuur, is gepubliceerd in Science Advances. Isotherme DNA-amplificatie en CRISPR-meting worden gecombineerd in één reageerbuis; twee conservatieve M. tuberculosis-inserties (IS6110 en IS1081) worden tegelijkertijd getest, plus een menselijk gen als interne monstercontrole. In een kleine "blinde" test op klinische monsters gaf de test 100% sensitiviteit (6/6) en 100% specificiteit (7/7) vergeleken met kweek; de detectielimiet is ~69–81 CFU/ml in gesimuleerd sputum. Het resultaat is af te lezen op een papieren teststrip en de reagentia zijn gevriesdroogd (bewaring zonder "koudeketen").

Achtergrond

Volgens de WHO zal tuberculose in 2023 ongeveer 1,25 miljoen mensen het leven kosten; tuberculose is opnieuw de belangrijkste infectieuze doodsoorzaak geworden, met naar schatting 10,8 miljoen gevallen. Dit maakt toegankelijke en snelle diagnostiek cruciaal, vooral in gebieden met beperkte middelen.

• Huidige tests zijn een compromis tussen nauwkeurigheid, snelheid en prijs. De 'gouden standaard'-kweek is zeer nauwkeurig maar traag; microscopie is snel maar ongevoelig; PCR-platforms zoals Xpert MTB/RIF Ultra zijn aanzienlijk gevoeliger (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), maar vereisen dure apparatuur en cartridges, wat de dekking beperkt.
• Waarom isotherm en CRISPR? Isotherme RPA-amplificatie werkt bij 37-42 °C en vereist geen thermocyclers – handig "in het veld". CRISPR-meting (Cas12/13) voegt soortspecificiteit toe en maakt visuele laterale stroming ("strip") mogelijk zonder complexe optica. Kortom, dit is de weg naar draagbare en goedkope PVR-testen.
• Waarom twee MBT-doelen tegelijk (IS6110 + IS1081). IS6110 is een multikopie-insert van het M. tuberculosis- complex, maar sommige lijnen hebben weinig kopieën, waardoor tests op alleen IS6110 mogelijk 'missen'. Het toevoegen van een tweede IS1081-insert vermindert het risico op vals-negatieve resultaten.
• Waarom interne menselijke controle? Ademmonsters kunnen remmers en "slechte" monsters bevatten. Endogene menselijke controle (bijv. RNase P/genoom-DNA) bevestigt dat het materiaal adequaat is en de reactie niet onderdrukt wordt - anders kan het resultaat niet als negatief worden beschouwd.
• Het éénpotformaat is op zichzelf al belangrijk. Het vermindert het aantal stappen, vermindert het risico op besmetting en vergemakkelijkt het werk buiten het laboratorium. Dergelijke benaderingen voor tuberculose hebben hun haalbaarheid al bewezen; het nieuwe werk breidt het idee uit naar een dual-targetformaat met interne controles, en demonstreert bovendien het lyofiliseren van reagentia en een striplezer.
• Wat is de waarde van het huidige artikel? De auteurs toonden detectie direct uit sputum aan na de meest vereenvoudigde monsterbereiding, met een detectielimiet van ~70-80 CFU/ml in gesimuleerd sputum en een sensitiviteit/specificiteit van 100% op een kleine blinde set klinische monsters – een goede "tech demo" voor verdere multicenter validaties.

Hoe werkt dit

• De wetenschappers combineerden RPA (snelle isothermische amplificatie van genetisch materiaal bij 37 °C) met de "knippende" enzymen Cas13a/Cas12a. Nadat ze de gids-RNA's hadden geselecteerd, configureerden ze het systeem om twee MBT-targets tegelijk aan te pakken, parallel aan menselijk DNA (om te controleren of er überhaupt materiaal in het monster aanwezig is en de reactie niet "vastgelopen" is).
• Alle chemische stoffen gaan in één reageerbuisje. Na incubatie wordt het resultaat afgelezen met een fluorimeter of op een laterale flowstrip. Dit lijkt in principe op een snelle test.
• De verwerking van sputum is vereenvoudigd tot verhitting en een korte centrifuge – zonder nucleïnezuurextractoren. Voor de meest beperkte omstandigheden bespreken de auteurs zelfs handmatige alternatieven voor de centrifuge.

Wat de tests lieten zien

• Detectielimiet: 69,0 CFU/ml (stam H37Rv) en 80,5 CFU/ml (BCG) in "spike" sputum. Er werd geen kruisreactiviteit met andere bacteriën/schimmels vastgesteld.
• Klinische setting (geblindeerde monsters): op 13 monsters uit de praktijk - 100% sensitiviteit (6/6) en 100% specificiteit (7/7) ten opzichte van seeding. Ter vergelijking: GeneXpert Ultra toonde op dezelfde kit respectievelijk 100%/86%.
• Technische nuances: van de twee uitleesopties werkte Cas13a beter (voor het "one-pot"-formaat is het gevoeliger dan Cas12a). Bovendien vermindert parallel testen van twee MTB-doelen het risico op onjuiste resultaten.

Waarom is dit nodig?

De huidige tests zijn een compromis tussen nauwkeurigheid, snelheid en beschikbaarheid: kweek is zeer nauwkeurig maar traag; swabs zijn snel maar onnauwkeurig; PCR-systemen zoals GeneXpert zijn nauwkeurig en snel, maar vereisen dure instrumenten en cartridges. De nieuwe CRISPR-aanpak wil deze kloof dichten: velddiagnostiek die werkt bij 37 °C, met metingen op papierstrips en de mogelijkheid om reagentia ongekoeld te bewaren.

Beperkingen en wat nu?

Dit is een vroege demonstratie op een kleine klinische set - er zijn grote, multicenter tests nodig (inclusief HIV-co-infectie, bij kinderen, met paucibacillaire vormen en verschillende MBT-lijnen). De auteurs merken afzonderlijk op dat in de "veld"-versie zelf de tafelcentrifuge vervangen zal moeten worden door een volledig handmatige oplossing. Maar de architectuur zelf - "twee targets + interne controle" in één reageerbuis - heeft zijn bruikbaarheid al bewezen en biedt een duidelijk pad naar verfijning voor massaal gebruik.

Bron: Alexandra G. Bell et al. Een gestroomlijnde CRISPR-gebaseerde test voor tuberculosedetectie rechtstreeks uit sputum, Science Advances, online 6 augustus 2025 (Vol. 11, nummer 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206