Niet-virale gentherapie biedt hoop voor chronische lage rugpijn

In een recent onderzoek gepubliceerd in het tijdschrift Biomaterials hebben onderzoekers een nieuwe, niet-virale gentherapie ontwikkeld voor de behandeling van discogene rugpijn (DBP) door de transcriptiefactor Forkhead Box F1 (FOXF1) met behulp van geconstrueerde extracellulaire blaasjes (eEV's) in vivo in degeneratieve tussenwervelschijven (IVD's) te brengen.

Chronische lage rugpijn (LRP) is een groeiend wereldwijd probleem als gevolg van de vergrijzing en de toenemende opioïdenproblematiek. Huidige behandelingen bestaan uit kortdurende verlichting of dure operaties, wat de behoefte aan niet-verslavende en minder ingrijpende therapieën onderstreept.

Huidige biologische benaderingen, waaronder toediening van groeifactoren, celtherapie en virale gentherapie, kunnen degeneratie in dier- en mensmodellen verminderen. Problemen zoals kortetermijneffecten, slechte werkzaamheid op lange termijn en onnodige immunogeniciteit en oncogeniciteit kunnen echter de directe toepassing van deze benaderingen belemmeren.

In deze studie ontwikkelden de onderzoekers een niet-virale gentherapie voor tussenwervelschijfdegeneratie (IVD) met behulp van FOXF1-eEV.

De onderzoekers transfecteerden primaire muizenembryonale fibroblasten (PMEF) met plasmiden die FOXF1 of pCMV6 bevatten als controle en karakteriseerden eEV-monsters met behulp van een nanoparticle tracking assay (NTA).

Ze beoordeelden de efficiënte belading van moleculaire lading in eEV's met behulp van kwantitatieve reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (qRT-PCR) en conventionele PCR. Western blot-analyse identificeerde FOXF1- en EV-specifieke eiwitten in eEV-formaties. Het team gebruikte plasmiden die de bovenste en onderste polylinkerregio's versterken om de aanwezigheid van FOXF1-plasmide-DNA in donorcellen te bepalen en genereerde eEV's.

Ze onderzochten het volledige mRNA geproduceerd uit plasmide-DNA in eEV's en donorcellen.

Onderzoekers creëerden extracellulaire blaasjes met transcriptiefactoren om de weefselfunctie te herstellen en pijnreacties te veranderen in een diermodel van DBP.

Ze identificeerden EV's voor het transport en de distributie van FOXF1 in beschadigde tussenwervelschijven in een muismodel van discogene rugpijn om te bepalen hoe FOXF1 eEV de degeneratie van tussenwervelschijven remt.

Het team combineerde biomechanische testen van de tussenwervelschijven bij muizen met beeldvorming, veranderingen in de extracellulaire matrix (ECM) en pijnreacties die na 12 weken werden beoordeeld om veranderingen in structuur en functie, evenals pijn, veroorzaakt door de therapeutische interventie te bevestigen.

Preoperatieve en postoperatieve pijnbeoordelingen omvatten microcomputertomografie (micro-CT), magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), mechanische testen, Alcian-blauw (AB) en Picrosirius-rood (PSR)-kleuring, de dimethylmethyleenblauwtest en immunohistochemie (IHC).

Het onderzoek omvatte een chirurgische techniek waarbij onderzoekers Buprenorfine ER subcutaan toedienden aan muizen om postoperatieve pijn te beheersen.

Het team voerde gedragsbeoordelingen uit vóór de operatie en elke twee weken van vier tot twaalf weken na de operatie, waarbij verschillende methoden werden gebruikt, waaronder de open veldtest, koude plaat, staart-ophanging en draad-ophanging.

Bij de open veldtest werd de spontane activiteit van muizen gemeten; bij koudeplaattesten werd thermische hyperalgesie gemeten; bij staartophangingstests werd axiale pijn gemeten; en bij draadophangingstests werd de sterkte gemeten.

Twaalf weken na de operatie disseceerde het team de lumbale wervelkolommen van de dieren met behulp van femorale zenuw- en arterietracering om tussenwervelschijven tussen L4 en L5, L5 en L6, en L6 en S1 IVD te identificeren. Ze gebruikten de L5/L6 IVD om de histologie te beoordelen en het glycosaminoglycaan (GAG)-gehalte te bepalen.

FOXF1 eEV's verminderden de pijnreacties aanzienlijk en herstelden de structuur en functie van het IVD, waaronder verbeterde schijfhoogte, weefselhydratatie, proteoglycaangehalte en mechanische eigenschappen.

De studie richtte zich op de afgifte van met FOXF1 beladen eEV's uit primaire fibroblasten die getransfecteerd waren met de transcriptiefactor FOXF1. Kwantitatieve RT-PCR toonde een significante toename van de FOXF1 mRNA-transcriptieniveaus en de volledige getranscribeerde FOXF1 mRNA-niveaus vergeleken met pCMV6-getransfecteerde cellen.

FOXF1 eEV-therapie kan pijnreacties in een lumbale discuspunctiemodel bij muizen tot wel 12 weken verminderen. Vrouwelijke muizen vertoonden langere aanvalsduren in de met FOXF1 behandelde groep dan in de geblesseerde groep, en deze duurden minstens 12 weken na de behandeling.

FOXF1 eEV-therapie verbeterde de hydratatie en hoogte van IVD-weefsel bij gewonde en degeneratieve dieren in vivo, terwijl de hydratatieniveaus en de T2-gewogen beeldintensiteit van de IVD-schijf op peil bleven.

Het team observeerde echter een afname van de discushoogte bij gewonde dieren en dieren die behandeld werden met pCMV6 eEV. Muizen behandeld met FOXF1 eEV vertoonden 12 weken na de behandeling geen afname van de discushoogte. Geslacht had geen invloed op de functionele uitkomsten.

FOXF1 eEV's herstelden de mechanische functie van beschadigde en gedegenereerde IVD's in vivo. Onder axiale belasting vertoonden met FOXF1 eEV's behandelde IVD's een hogere genormaliseerde NZ-stijfheid in vergelijking met beschadigde IVD's.

Onder kruipomstandigheden vertoonden beschadigde IVD's een verhoogde genormaliseerde kruipverplaatsing, wat duidt op een afname van de genormaliseerde kruip-elastische stijfheid.

Uit de resultaten blijkt dat het verlagen van het GAG-gehalte in beschadigde IVD's de mechanische flexibiliteit verhoogt, terwijl eEV-therapie het verlies van glycosaminoglycanen en de daaropvolgende veranderingen in mechanische functie voorkomt.

FOXF1 eEV's veroorzaken structurele en functionele veranderingen bij IVD door de proteoglycaan- en GAG-niveaus te verhogen.

Uit de resultaten van het onderzoek bleek dat eEV's die geladen zijn met ontwikkelingstranscriptiefactoren, pijnlijke gewrichtsziekten zoals DBP kunnen behandelen door deze transcriptiefactoren via IVD in degeneratieve en pijnlijke gewrichten af te leveren.

Deze strategie kan helpen de structurele en functionele afwijkingen die door de ziekte worden veroorzaakt te verminderen en de pijnreacties op een geslachtsspecifieke manier te reguleren.

De onderzoekers adviseerden ook om ontwikkelingstranscriptiefactoren zoals FOXF1 te gebruiken om degeneratieve NP-cellen in vivo in een pro-anabole toestand te brengen. Verder onderzoek is nodig om de therapeutische werkzaamheid ervan te bepalen.