Niet-virale gentherapie biedt hoop voor chronische lage rugpijn

In een recente studie gepubliceerd in het tijdschrift Biomaterials ontwikkelden onderzoekers een nieuwe niet-virale gentherapie om discogene rugpijn (DBP) te behandelen door de transcriptiefactor Forkhead af te geven Box F1 (FOXF1) met behulp van speciaal ontworpen extracellulaire blaasjes (eEV's) in degeneratieve tussenwervelschijven (IVD's) in vivo.

Chronische lage rugpijn (LRP) is een groeiend mondiaal probleem als gevolg van de vergrijzing van de bevolking en de verergerende problemen met opioïden. De huidige behandelingen omvatten verlichting op de korte termijn of dure operaties, wat de noodzaak van niet-verslavende en minder invasieve therapieën onderstreept.

De huidige biologische therapieën, waaronder toediening van groeifactoren, celtherapie en virale gentherapieën, kunnen degeneratie in dier- en menselijke modellen verminderen. Zorgen zoals kortetermijneffecten, slechte werkzaamheid op de lange termijn en onnodige immunogeniciteit en tumorigeniciteit kunnen de directe toepassing van deze methoden echter in de weg staan.

In deze studie hebben onderzoekers een niet-virale gentherapie ontwikkeld voor degeneratie van tussenwervelschijven (IVD) met behulp van FOXF1-eEV.

De onderzoekers transfecteerden primaire embryonale fibroblasten (PMEF's) van muizen met een plasmide dat FOXF1 of pCMV6 als controle bevatte en karakteriseerden eEV-monsters met behulp van nanoparticle tracking assay (NTA).

Ze beoordeelden de efficiënte belasting van moleculaire lading in eEV's met behulp van kwantitatieve reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (qRT-PCR) en conventionele PCR. Western blot-analyse identificeerde FOXF1 en specifieke EV-eiwitten in eEV-formaties. Het team gebruikte plasmiden die de stroomopwaartse en stroomafwaartse polylinkerregio's versterken om de aanwezigheid van FOXF1-plasmide-DNA in donorcellen te bepalen en eEV's te genereren.

Ze onderzochten mRNA van volledige lengte, geproduceerd uit plasmide-DNA in eEV's en donorcellen.

Onderzoekers creëerden extracellulaire blaasjes met transcriptiefactoren om de weefselfunctie te herstellen en pijnreacties te wijzigen in een diermodel van DBP.

Ze identificeerden EV's om FOXF1 te transporteren en te distribueren naar beschadigde tussenwervelschijven in een muismodel van discogene rugpijn om de FOXF1 eEV-remming van tussenwervelschijfdegeneratie te bepalen.

Het team combineerde biomechanische testen van tussenwervelschijven van muizen met beeldvorming, veranderingen in de extracellulaire matrix (ECM) en pijnreacties beoordeeld na 12 weken om veranderingen in structuur en functie te bevestigen, evenals pijn veroorzaakt door de therapeutische interventie.

>

Pijnbeoordelingen vóór en na de behandeling omvatten micro-computertomografie (micro-CT), magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), mechanische tests, Alcian-blauw (AB) en picrosirius rood (PSR)-kleuring, dimethylmethyleenblauw-test en immunohistochemie (IHC). ) ).

Het onderzoek omvatte een chirurgische techniek waarbij onderzoekers Buprenorfine ER subcutaan in muizen injecteerden om postoperatieve pijn onder controle te houden.

Het team voerde vóór de operatie en elke twee weken van vier tot twaalf weken na de operatie gedragsbeoordelingen uit, waarbij gebruik werd gemaakt van een verscheidenheid aan technieken, zoals de open veldtest, koude plaat, staartophanging en draadophanging.

De openveldtest beoordeelde de spontane activiteit van muizen; koude plaattests maten thermische hyperalgesie; Bij staartophangingstests werd axiale pijn gemeten; en draadophangingstests gemeten sterkte.

Twaalf weken na de operatie ontleedde het team de lumbale stekels van de dieren, met behulp van femorale zenuw- en slagaderonderzoek om tussenwervelschijven tussen L4 en L5, L5 en L6, en L6 en S1 IVD te identificeren. Ze gebruikten L5/L6 IVD om de histologie te evalueren en het glycosaminoglycaangehalte (GAG) te bepalen.

FOXF1 eEV's verminderden de pijnreacties aanzienlijk terwijl ze de IVD-structuur en -functie herstelden, inclusief verbeteringen in de schijfhoogte, weefselhydratatie, proteoglycaangehalte en mechanische eigenschappen.

De studie concentreerde zich op de afgifte van met FOXF1 geladen eEV's uit primaire fibroblasten die waren getransfecteerd met de FOXF1-transcriptiefactor. Kwantitatieve RT-PCR toonde een significante toename aan in FOXF1-mRNA-transcriptniveaus en getranscribeerde FOXF1-mRNA-niveaus over de volledige lengte vergeleken met cellen getransfecteerd met pCMV6.

FOXF1 eEV-therapie kan de pijnreacties in een muismodel met lumbale schijfpunctie gedurende maximaal 12 weken verminderen. Vrouwelijke muizen vertoonden langere acquisitietijden in de met FOXF1 behandelde groep dan in de laesiegroep, die ten minste twaalf weken na de behandeling aanhield.

FOXF1 eEV-therapie verbeterde de hydratatie en IVD-weefselhoogte bij gewonde en degeneratieve dieren in vivo, terwijl de hydratatieniveaus en de T2-gewogen IVD-beeldintensiteit behouden bleven.

Het team observeerde echter een afname van de schijfhoogte bij gewonde dieren en dieren behandeld met pCMV6 eEV. Muizen behandeld met FOXF1 eEV hadden 12 weken na de behandeling geen vermindering van de schijfhoogte. Geslacht had geen invloed op de functionele resultaten.

FOXF1 eEV's herstelden de mechanische functie van beschadigde en gedegenereerde IVD's in vivo. Onder axiale spanning vertoonden met FOXF1 eEV behandelde IVD's een hogere genormaliseerde NZ-stijfheid vergeleken met beschadigde IVD's.

Onder kruipomstandigheden vertoonden beschadigde IVD's verhoogde genormaliseerde kruipverplaatsingen, wat wijst op een afname van de genormaliseerde kruipelastische stijfheid.

De resultaten laten zien dat het verminderen van het GAG-gehalte in beschadigde IVD's de mechanische flexibiliteit vergroot, maar eEV-therapie voorkomt het verlies van glycosaminoglycanen en daaropvolgende veranderingen in de mechanische functie.

FOXF1 eEV's veroorzaakten structurele en functionele veranderingen in IVD door de niveaus van proteoglycanen en GAG's te verhogen.

De onderzoeksresultaten toonden aan dat eEV's boordevol ontwikkelingstranscriptiefactoren pijnlijke gewrichtsziekten zoals DBP kunnen behandelen door deze transcriptiefactoren af te geven aan degeneratieve en pijnlijke IVD-gewrichten.

Deze strategie kan helpen bij het verminderen van structurele en functionele afwijkingen die door de ziekte worden veroorzaakt, en bij het reguleren van genderspecifieke pijnreacties.

Onderzoekers hebben ook aanbevolen om ontwikkelingstranscriptiefactoren zoals FOXF1 te gebruiken om degeneratieve NP-cellen in vivo om te zetten in een pro-anabole toestand. Verder onderzoek is nodig om de therapeutische effectiviteit ervan te bepalen.