Mesenchymale stamcellen

Van de regionale stamcellen nemen mesenchymale stamcellen (MSC's) een speciale plaats in, waarvan de derivaten de stromale matrix vormen van alle organen en weefsels van het menselijk lichaam. Prioriteit in het onderzoek van MSC behoort tot vertegenwoordigers van de Russische biologische wetenschap.

In het midden van de vorige eeuw werd een homogene kweek van multipotente stromale beenmergstamcellen voor het eerst geïsoleerd in het laboratorium van A. Friedenshtein. Mesenchymale stamcellen gehecht aan een substraat voor een lange tijd behouden een hoge proliferatiesnelheid en kweken bij lage zaaidichtheid na fixatie op een substraat gevormd uit fibroblast celklonen zonder fagocytose. De stop van MSC-proliferatie werd beëindigd door hun spontane in vitro differentiatie tot bot-, vet-, kraakbeen-, spier- of bindweefselcellen. Verdere studies hebben het mogelijk gemaakt om het osteogene potentieel van fibroblast-achtige cellen van het beenmergstroma van verschillende zoogdiersoorten vast te stellen, evenals hun kolonievormende activiteit. In experimenten in vivo werd aangetoond dat zowel hetero- en orthotope transplantatie van fibroblast kolonievormende cel voltooid vormende bot, kraakbeen en vezelig vetweefsel. Aangezien beenmergstamcellen een hoge capaciteit hebben voor zelfvernieuwing en een verscheidenheid aan differentiatie binnen een enkele cellijn, worden ze multipotente mesenchymale voorlopercellen genoemd.

Opgemerkt moet worden dat gedurende 45 jaar fundamenteel onderzoek van mesenchymale stamcellen, reële voorwaarden zijn gecreëerd voor het gebruik van hun derivaten in de klinische praktijk.

Tegenwoordig lijdt het geen twijfel dat alle weefsels van het menselijk lichaam worden gevormd uit de stamcellen van verschillende cellijnen als een resultaat van processen van proliferatie, migratie, differentiatie en rijping. Meer recentelijk werd echter aangenomen dat stamcellen in het volwassen lichaam weefselspecifiek zijn, dat wil zeggen dat ze alleen gespecialiseerde cellijnen kunnen produceren van de weefsels waarin ze zich bevinden. Deze conceptuele situatie werd weerlegd door de feiten van transformatie van hematopoietische stamcellen niet alleen in cellulaire elementen van perifeer bloed, maar ook in ovale levercellen. Bovendien konden neurale stamcellen aanleiding geven tot zowel neuronen- als gliale elementen, evenals vroeg toegewijde lijnen van hematopoietische voorlopercellen. Op hun beurt kunnen mesenchymale stamcellen, die gewoonlijk cellulaire elementen van bot, kraakbeen en vetweefsel produceren, transformeren in neurale stamcellen. Aangenomen wordt dat tijdens het groeiproces, fysiologische en reparatieve weefselregeneratie, niet-gecommitteerde progenitorcellen worden gegenereerd uit weefselspecifieke stamreserves. Herstel van spierweefsel kan bijvoorbeeld worden gerealiseerd door middel van mesenchymale stamcellen die migreren van het beenmerg naar skeletspieren.

Hoewel dergelijke onderlinge verwisselbaarheid stamcellen herkennen niet alle onderzoekers de mogelijkheid klinisch gebruik van de mesenchymale stamcellen als bron voor celtransplantatie en cellen vector van genetische informatie niet betwisten multipotente stromale beenmergstamcellen die relatief gemakkelijk te isoleren zijn en voortplanten in cultuur in vitro. Tegelijkertijd blijven er in de wetenschappelijke literatuur meldingen van potentiële pluripotentie in stamcellen van het beenmergstroma. Als bewijs gepresenteerd onderzoeksprotocols, die onder invloed van specifieke inductoren van transdifferentiatie van MSC's worden omgezet in zenuwcellen, hepatocyten en cardiomyocyten. In sommige wetenschappers is de mogelijkheid van re-activatie en expressie van genen van vroege embryogenese echter zeer twijfelachtig. Op hetzelfde moment, iedereen begrijpt dat indien er omstandigheden worden gevonden om de multipotente mesenchymale stamcellen uit te breiden naar pluripotentie van de SER in de regeneratieve geneeskunde en plastic automatisch opgelost veel problemen van ethische, morele, religieuze en juridische aard. Aangezien in dit geval de bron van stamcellen regeneratievermogen van de patiënt autologe bindweefselcellen opgelost en het probleem van afstoting van transplantaat. Hoe reëel deze vooruitzichten zijn, zal de nabije toekomst laten zien.

[1], [2], [3], [4]

Gebruik van mesenchymale stamcellen in de geneeskunde

De kliniek gebruik van derivaten van mesenchymale stamcellen is voornamelijk geassocieerd met de vermindering van weefsel defecten veroorzaakt door grote en diepe thermische huidlaesies. Preklinische experimentele evaluatie van de geschiktheid van allogene fibroblast-achtige mesenchymale stamcellen voor de behandeling van diepe brandwonden werd uitgevoerd. Er wordt aangetoond dat de fibroblast-achtige beenmerg mesenchymale stamcellen vormen een monolaag in de kweek, waardoor het mogelijk is ze te transplanteren op de regeneratie van diepe brandwonden optimaliseren. De auteurs constateren dat dezelfde eigenschappen hebben embryonale fibroblasten, maar de klinische toepassing van deze laatste is beperkt tot de bestaande ethische en juridische problemen. Een diepe thermische verbranding met schade aan alle lagen van de huid werd gemodelleerd op Wistar-ratten. Het gebied van de brandwond was 18-20% van het totale oppervlak van de huid. In het eerste experimentele groep bestond uit ratten met diepe thermische verwonding en de transplantatie van allogene fibroblast-afgeleide mesenchymale stamcellen. De tweede groep bestond uit dieren met diepe brandwonden en trans-plantage van allogene embryonale fibroblasten. De derde groep werd vertegenwoordigd door controleratten met een diepe thermische verbranding, die geen cellulaire therapie uitvoerde. Een suspensie van fibroblast-afgeleide mesenchymale stamcellen en embryonale fibroblasten werd aangebracht op een brandwond wondoppervlak gepipetteerd in een hoeveelheid van 2 x 10 ⁴ cellen op de 2e dag na excisie van brandwonden modellering en necrotische korst vormde. Na transplantatie cellen branden oppervlak bedekt met gaas geweekt in isotone natriumchlorideoplossing met gentamicine. Hek beenmergcellen MSCs met daaropvolgende inductie van fibroblast lijn in mesenchymale stamcellen verkregen bij volwassen Wistar ratten scheen- verkrijgen. Embryonale fibroblasten werden verkregen uit de longen van 14-17 dagen oude embryo's. Embryonale fibroblasten en beenmergcellen het verkrijgen van een pre-MSC's werden gekweekt in petrischalen bij 37 ° C in een C02 iikubatore, in een atmosfeer met 5% CO2 bij 95% luchtvochtigheid. Embryonale fibroblasten gekweekt gedurende 4-6 dagen, terwijl voor monolaag vorming MSC vereist 14-17 dagen. Vervolgens MSCs gehandhaafd door cryopreservatie als uitgangsmateriaal voor fibroblast-afgeleide mesenchymale stamcellen die werden bereid door ontdooien en kweken van MSC's gedurende 4 dagen. Aantal fibroblast-gegenereerde mesenchymale stamcellen is meer dan 3 maal het aantal embryonale fibroblasten die tijdens dezelfde kweekperiode. Te identificeren cellen transtslantirovannyh brandwonden in stap kweken hun genoom gelabeld met virale shuttlevector basis van een recombinant adenovirus V typendrager 1as-2 gen codeert ß-galactosidase van E. Coli. Levende cellen op verschillende tijdstippen na transplantatie gedetecteerd immunohistochemisch in de vriescoupes met toegevoegde substraat X-Gal, waardoor de karakteristieke blauw-groene kleur. Als gevolg van de visuele dynamiek, planimetrische en histologische evaluatie conditie van brandwonden, bleek dat zelfs op de 3e dag na de transplantatie van de cellen in geïsoleerde groepen blijken significante verschillen in wondgenezing. Vooral verschillend, dit verschil werd op de 7e dag na celtransplantatie. De dieren van de eerste groep werden getransplanteerd fibroblast-achtige mesenchymale stamcellen, gewikkeld verworven uniform roze intense kleur, granulatieweefsel gegroeid over zijn gehele oppervlak op het niveau van de epidermis en het oppervlak verbrandt aanzienlijk verkleind. Verschillende gevormde dunnere collageen film op het wondoppervlak, maar ze bleef het gehele gebied van het branden te dekken. De dieren van de tweede groep embryonale fibroblasten werden getransplanteerd, wordt granulatieweefsel opgetild naar het niveau van de epidermis van de wondranden, maar op sommige plaatsen, tegelijkertijd plazmoreya uit de wond intenser was dan in groep 1, en aanvankelijk gevormde collageenfolie nagenoeg verdwenen. Bij dieren die geen stamcel therapie heeft ontvangen, op de 7de dag brandwond was een bleke, ontpit, necrotisch weefsel, bedekt met fibrine. Plasmorrhoea werd overal op het brandoppervlak genoteerd. Histologisch, de dieren van de 1e en 2e groepen vertoonden een daling van cellulaire infiltratie en de ontwikkeling van het vaatstelsel, hebben deze tekenen van beginnende regenerator proces in groep 1 ernstiger is in de ratten. In de controlegroep vertoonden tekenen van cel wond infiltratie, de histologische patroon van de nieuw gevormde bloedvaten afwezig. 15-30 ste dag van de opmerking van de dieren van de 1e groep burn oppervlak was aanzienlijk kleiner dan bij de ratten van andere groepen en granuleren oppervlak was meer ontwikkeld. Bij de dieren van groep 2 brandvlak gebied is ook gedaald in vergelijking met de afmeting van brandwonden bij de controlegroep van ratten die als gevolg van marginale epithelisatie was. In de controlegroep bleef groep brandvlak plaatsen bleek granulaten met zeldzame, daarop spataderen verschijnen, eilandjes waren fibrineuze plaques bleven gematigd plazmoreya in brandvlak, hetgeen moeilijk losneembaar schurft gebleven. Over het algemeen dieren van groep 3 vermindert ook de grootte van de wond, maar de wond bleef podrytymi rand.

Aldus tijdens een vergelijkende studie van wondgenezing onder toepassing fibroblast afgeleide mesenchymale stamcellen en foetale fibroblasten en zonder gebruik van celtherapie duidelijke versnelling van de genezing van brandwonden oppervlak als gevolg van transplantatie van fibroblast afgeleide mesenchymale stamcellen en embryonale fibroblasten. In het geval dat allogeneïsche mesenchymale stamcellen van fibroblast wondgenezende hoger was dan bij de transplantatie van embryonale fibroblasten. Hierin is in snellere veranderingen regeneratie fasen van het proces - cellulaire infiltratie perioden verminderen, verhoogt de snelheid van vermeerdering van vasculaire netwerken, alsmede de vorming van granulatieweefsel.

De resultaten van dynamische planimetrie geven aan dat de snelheid van de spontane genezing van de brandwond (zonder het gebruik van celtherapie) het laagst was. Op de 15e en 30e dag na de transplantatie van allogene mesenchymale stamcellen van fibroblast wondgenezing was hoger dan in de transplantatie van embryonale fibroblasten. Histochemische detectiemethode voor beta-galactosidase toonde aan dat na transplantatie van fibroblast-achtige mesenchymale stamcellen en embryonale fibroblasten gedurende de gehele waarnemingsperiode op het oppervlak en diepe wonden regenereren getransplanteerde cellen levensvatbaar blijven. De auteurs suggereren dat een hoger percentage van brandwonden regeneratie met behulp van mesenchymale stamcellen van fibroblast-afgifte door deze cellen geconditioneerd tijdens de rijping rostostimuliruyushih bioactieve factoren.

Transplantatie van autologe of allogene keratinocyten en fibroblasten allogene voor de behandeling van brandwonden en in de kliniek. Opgemerkt dient te worden dat de chirurgische behandeling van kinderen met uitgebreide diepe brandwonden is een ingewikkelde taak te wijten aan de hoge veelheid van trauma en chirurgische ingrepen, significant bloedverlies, op de verschillende reacties gebruikt infusie media. De grootste problemen bij de uitvoering van de huid en plastische chirurgie met uitgebreide diepe brandwonden, de oppervlakte van meer dan 40% van het lichaamsoppervlak, vanwege de ernst van haar toestand en het gebrek aan middelen van donorhuid. Het gebruik van mesh enten met grote perforatie ratio niet het probleem op te lossen, aangezien het beeld na epiteliziruyutsya cel perforatie is erg traag, en vaak huidtransplantaties worden gelyseerd of droog. Dergelijke bekledingen brandwonden als ksenokozha, cadaveric allotransplantaten, kunststoffolie deklagen niet altijd voldoende effectief, zodat de ontwikkeling van nieuwe methoden voor het sluiten van brandwonden oppervlaktelagen van gekweekte keratinocyten en fibroblasten. In het bijzonder, een werkwijze voor het sluiten van brandwonden oppervlakken met gekweekte allofibroblastov verschaffen tijdens transplantatie uitgesproken stimulerend effect op de proliferatie epidermotsitov bewaard in de wondrand bij brandwonden, en keratinocyttransplantaten mesh weefsels. In de Budkevich L. Et al (2000) toont de resultaten van toepassing van deze werkwijze voor de behandeling van brandwonden bij kinderen. 31 kinderen met thermisch trauma in de leeftijd van 1 tot 14 jaar werden geobserveerd. Bij drie kinderen totale oppervlakte brandwonden IIIA-B - IV graad bedroeg 40%, 25 - 50-70%, zelfs op de drie - 71-85% van het lichaamsoppervlak. Vroege chirurgische necrectomy gecombineerd met transplantatie van gekweekte allofibroblastov en autodermaplasty. In de eerste fase behandeling werd uitgevoerd necrotisch weefsel excisie, de tweede - de transplantatie van gekweekte allofibroblastov dragerfolie, de derde (48 uur na transplantatie van gekweekte allofibroblastov) - verwijdering van de matrix en huidplooien met autodermoplasty perforatie verhouding van 1: 4. Drie patiënten opgenomen in het ziekenhuis met ernstige brandwonden en vaatziekten, werden gekweekt allofibroblasty getransplanteerd op granulerende wonden. Transplantatie van gekweekte allofibroblastov uitgevoerd eenmaal in 18 kinderen, twee keer - op 11, 3-2 patiënten. Het oppervlak van het wondoppervlak bedekt door de celkweek was van 30 tot 3500 cm2. De werkzaamheid van gekweekte allofibroblastov geëvalueerd door het totale percentage van de innesteling van de huid flappen, het tijdstip van genezing van brandwonden en het aantal sterfgevallen ernstig thermisch letsel. De transplantatie van transplantaties was volledig bij 86% van de patiënten. Een gedeeltelijke niet-weergave van de huidflappen werd opgemerkt in 14% van de gevallen. Ondanks de lopende behandeling stierven zes (19,3%) kinderen. Het totale gebied van de huidlaesie daarin was van 40 tot 70% van het lichaamsoppervlak. Transplantatie van gekweekte allofibroblastov had geen verband met de dood van brandwonden een enkele patiënt.

Het analyseren van de resultaten van de behandeling, de auteurs constateren dat de vorige brandwonden onverenigbaar zijn met het leven, tot diep thermische beschadiging van de huid gebied van 35-40% van het lichaamsoppervlak (voor jonge kinderen te behandelen - tot 3 jaar - zijn van cruciaal belang diepe brandwonden met een oppervlakte van 30%, voor oudere kinderen leeftijd - meer dan 40% van het lichaamsoppervlak). Wanneer de chirurgische transplantatie van gekweekte necrectomy allofibroblastov autodermaplasty en daaropvolgende huidtransplantaties met grote brandwonden, perforatie factor IIIB - IV mate kritisch blijven, maar op dit moment zijn er vooruitzichten in veel gevallen om het leven van zelfs zulke slachtoffers te redden. Chirurgische necrectomy in samenhang met transplantatie van gekweekte allofibroblastov en autodermaplasty bij kinderen met diepe brandwonden bleek bijzonder effectief bij patiënten met gevorderde letsels van de huid met een tekort van donor locaties. Actieve chirurgische tactiek en het transplanteren van gekweekte allofibroblastov bevorderen een snelle stabilisatie van de algemene toestand van deze patiënten, de vermindering van het aantal infectieuze complicaties van burn-en vaatziekten, het creëren van gunstige voorwaarden voor de implantatie, verminderen de tijd om de verloren huid en de duur van de behandeling in het ziekenhuis te herstellen, het terugdringen van sterfgevallen bij patiënten met ernstige brandwonden. Aldus transplantatie van gekweekte allofibroblastov gevolgd autodermaplasty huidplooien bereikt herstel bij kinderen met ernstige brandwonden, die voorheen werden beschouwd gedoemd.

Het wordt algemeen erkend dat het primaire doel van het behandelen van een brandwondenziekte is om het volledige en snelle herstel van de beschadigde huid te maximaliseren om de resulterende toxische effecten, infectieuze complicaties en dehydratie van het lichaam te voorkomen. De resultaten van de toepassing van gekweekte cellen hangen grotendeels af van de bereidheid voor transplantatie van de brandwond zelf. In gevallen van transplantatie van gekweekte keratinocyten op het wondoppervlak na chirurgische necrectomy prizhivlyaetsya gemiddeld 55% (per gebied) van getransplanteerde cellen, terwijl de granulerende wonden incorporatiegetal wordt verlaagd tot 15%. Daarom vereist een succesvolle behandeling van uitgebreide diepe huidverbranding in de eerste plaats actieve chirurgische tactieken. In aanwezigheid van brandwonden IIIB-IV-graad wordt het brandoppervlak onmiddellijk vrijgegeven uit necrotische weefsels om de effecten van intoxicatie te verminderen en het aantal complicaties van brandwondenziekte te verminderen. Het gebruik van dergelijke tactieken is de sleutel tot het verminderen van de tijd vanaf het moment van het krijgen van een brandwond tot het sluiten van de wonden en de verblijfsduur van patiënten met uitgebreide brandwonden in het ziekenhuis, en ook het aanzienlijk verminderen van het aantal sterfgevallen.

De eerste rapporten over het succesvolle gebruik van gekweekte keratinocyten om het brandoppervlak te bedekken, verschenen in de vroege jaren tachtig van de vorige eeuw. Vervolgens werd deze manipulatie uitgevoerd met behulp van lagen gekweekte keratinocyten, meestal verkregen uit autocellen, veel minder vaak van allokeratinocyten. De technologie van autokeratinocytoplastie maakt echter niet de vorming van een celbank mogelijk, terwijl de tijd die nodig is om een voldoende ent van keratinocyten te produceren groot is en 3-4 weken bedraagt. Tijdens deze periode neemt het risico op het ontwikkelen van infectieuze en andere complicaties van brandwondenziekte sterk toe, wat de totale verblijfsduur van patiënten in het ziekenhuis aanzienlijk verlengt. Bovendien overleven autokeratinocyten praktisch niet tijdens transplantatie in granulerende brandwonden, en de hoge kosten van speciale groeimedia en biologisch actieve keratinocytgroeistimulanten beperken hun klinische toepassing aanzienlijk. Andere biotechnologische methoden, zoals collagenoplastie, transplantatie van gecryopreserveerde xenoïden en het gebruik van verschillende biopolymeercoatings verhogen de effectiviteit van behandeling van uitgebreide oppervlak maar niet diepe brandwonden. De werkwijze voor het coaten van het wondoppervlak met gekweekte fibroblasten is fundamenteel verschillend doordat de hoofdcomponent van de gekweekte celpool geen keratinocyten maar fibroblasten is.

Een voorwaarde voor de ontwikkeling van de methode diende als bewijs dat pericytes dat de kleine bloedvaten omringen zijn pro- genitornymi mesenchymale cellen in staat om te zetten in fibroblasten, die veel groeifactoren te produceren en zorgen voor wondgenezing als gevolg van het sterk stimulerende effect op de proliferatie en hechting van keratinocyten. Het gebruik van gekweekte fibroblasten om de wondoppervlakken te sluiten onthulde onmiddellijk een aantal significante voordelen van deze methode vergeleken met het gebruik van gekweekte keratinocyten. Met name ook de voorbereiding van de fibroblasten in cultuur niet het gebruik van speciale voedingsbodems en groeibevorderaars, die de kosten van transplantatie meer dan 10 keer de kosten van het verkrijgen van keratinocyten vermindert vereisen. Fibroblasten gemakkelijk onderworpen aan passage, waarin zij een gedeelte van hun oppervlak histocompatibiliteit antigenen, die op zijn beurt maakt het mogelijk om voor de vervaardiging van allogene transplantaten van cellen en creëren hun bank lopen. Verkort ontvangen transplantaties, klaar voor gebruik in een kliniek, vanaf 3 weken (keratinocyten) 1-2 dagen (voor fibroblasten). Primaire kweken van fibroblasten kan worden verkregen door het kweken van cellen van huidfragmenten genomen autodermoplasty en mobiele zaaidichtheid ontvangst subculturen van humane fibroblasten slechts 20 x 10 ³ per 1 cm ².

Om het effect van fibroblasten en hun regulerende eiwitten bij de proliferatie en differentiatie van keratinocyten, een vergelijkende analyse van de eigenschappen en morfologie van keratinocytproliferatie op substraten van collageen type I en III, en fibronectine in gezamenlijke kweek met humane fibroblasten te bestuderen. Menselijke keratinocyten werden geïsoleerd uit fragmenten van de huid van patiënten met brandwonden die werden genomen tijdens de werking van de autodermoplastiek. De dichtheid van keratinocyten was 50 x 103 cellen per cm2. De klinische werkzaamheid van transplantatie van gekweekte fibroblasten werd geëvalueerd bij 517 patiënten. Alle patiënten werden in twee groepen verdeeld: 1e - volwassenen met brandwonden IIA, B - IV graad; 2e - kinderen met diepe brandwonden van IIIB - IV graad. Beoordeling van de dynamiek van de structurele en functionele organisatie van de monolaag cultuur van fibroblasten met betrekking tot de rol in het regeneratieproces van glycosaminoglycanen, fibronectine, collageen, en liet de auteurs aan de derde dag vast te stellen als de meest gunstige voorwaarden voor het gebruik van fibroblast culturen voor de productie van transplantaties. Onderzoek van het effect op fibroblast proliferatie en differentiatie van keratinocyten is gebleken dat onder in vitro fibroblasten een uitgesproken stimulerende werking, vooral op keratinocyt adhesieprocessen, verhoging van het aantal hechtende cellen en de snelheid van de vaststelling meer dan 2 keer. Stimulering van adhesieprocessen gaat gepaard met een toename in de intensiteit van DNA-synthese en het niveau van proliferatie van keratinocyten. Verder werd gevonden dat de aanwezigheid van fibroblasten en extracellulaire matrix gevormd door hen is een voorwaarde voor de vorming tonofibrillyarnogo inrichting keratinocyten intercellulaire verbindingen en uiteindelijk voor keratinocyt differentiatie en vorming basismembraan. Bij de behandeling van kinderen met diepe brandwonden gevestigde klinische werkzaamheid van transplantatie allofibroblastov cultuur, vooral bij patiënten met uitgebreide letsels van de huid donor sites in een tekort. Complexe morfofunktcionalnoe studie toonde aan dat transplantaat kenmerk fibroblasten actieve DNA-synthese, en collageen, fibronectine en glycosaminoglycanen, die worden gegenereerd in de cellen van de extracellulaire matrix. De auteurs suggereren een hoog percentage van het aanslaan van getransplanteerde fibroblasten (tot 96%), een scherpe daling in termen van hun bereiding (binnen 2-3 uur in plaats van 24-48 weken in het geval van keratinocyten), een aanzienlijke versnelling van epithelisatie van de branden oppervlak, en een aanzienlijke verlaging van de prijs (in 10 tijden) van de technologie van het groeien van het transplantaat uit fibroblasten in vergelijking met keratinocyttransplantatie. Het gebruik van transplantatie van gekweekte allofibroblastov maakt het mogelijk om het leven van kinderen te redden met kritische brandwonden - thermische schade meer dan 50% van het lichaamsoppervlak, die voorheen onverenigbaar met het leven werd gedacht. Het is opmerkelijk dat allogene transplantatie van embryonale fibroblasten ook overtuigend bewezen niet alleen een snellere regeneratie van wonden en herstel patiënten met verschillende graad brandwonden en omgeving, maar ook een aanzienlijke vermindering van de mortaliteit.

Autologe fibroblasten worden gebruikt in zo'n ingewikkeld en plastische chirurgie als vervanging correctie schade die de stembanden. Gewoonlijk wordt voor dit doel rundercollageen gebruikt, waarvan de duur wordt beperkt door zijn immunogeniciteit. Waarbij een vreemd eiwit, collageen, collagenase gevoelig voor de ontvanger en kunnen immuunreacties veroorzaken aan het gevaar dat de technologie van collageen preparaten worden ontwikkeld verminderen, verknoopt met glutaaraldehyd. Het voordeel is grotere stabiliteit en lagere immunogeniteit, die praktische toepassing heeft gevonden bij het verwijderen van gebreken en stembanden atrofie. Injecties van autoloog collageen werden voor het eerst gebruikt in 1995. Werkwijzen verschaft behoud van de primaire structuur van autologe collageenvezels, enzymatisch gekatalyseerde intramoleculaire verknopingen. Dat natuurlijke collageenvezels zijn resistenter tegen afbraak door proteasen dan gereconstitueerd collageentelopeptiden waarbij cut. Integriteit telopeptiden belangrijk voor de quaternaire structuur van de collageenvezels en verknoping tussen naburige collageenmoleculen. In tegenstelling tot preparaten van collageen, heeft autoloog collageen veroorzaken immuunresponsen bij de ontvanger, maar onvoldoende effectief als middel vult. Aanhoudende correctie kan worden bereikt door lokale productie van collageen door autologe fibroblasttransplantatie. Uit het onderzoek van de effectiviteit van de transplantatie van autologe fibroblasten in de kliniek bracht een aantal problemen. In het begin van de periode na de transplantatie fibroblast klinische effect was zwakker in vergelijking met die na toediening van boviene collageen. Wanneer gekweekte autologe fibroblasten de mogelijkheid van transformatie van normale fibroblasten in abnormale niet kunnen uitsluiten, het zogenaamde myofibroblasten, verantwoordelijk voor de ontwikkeling van fibrose en littekenvorming, zoals blijkt uit de afname van collageengel, vanwege de specifieke interactie van fibroblasten en collageenvezels. Voorts na de seriële passages fibroblasten in vitro verliezen hun vermogen om extracellulaire matrixeiwitten synthetiseren.

Desalniettemin is op dit moment de techniek van het kweken van autologe humane fibroblasten experimenteel geëlimineerd, waarbij de bovengenoemde nadelen zijn geëlimineerd en niet hebben geleid tot oncogene transformatie van normale fibroblasten. Autologe fibroblasten verkregen volgens deze methode worden gebruikt om de defecten van de zachte weefsels van het gezicht te vullen. In een onderzoek van H. Keller en co-auteurs (2000) kregen 20 patiënten van 37 tot 61 jaar met rimpels en atrofische littekens een behandeling. Huidbiopten (4 mm) BTE gebied we naar het laboratorium getransporteerd in steriele buizen die 10 ml kweekmedium (Dulbecco antibioticum mikoseptikom, pyruvaat en foetaal runderserum). Het materiaal werd in 3-5 cultuurschalen met een diameter van 60 mm geplaatst en geïncubeerd in een thermostaat met een atmosfeer die 5% CO2 bevatte. Na 1 week werden de cellen door trypsinisatie uit de schalen verwijderd en in 25 cm2 flesjes geplaatst. Cellen worden toegediend aan patiënten in een hoeveelheid van 4 x 107. De aanzienlijke en langdurige klinische effect werd waargenomen bij patiënten met correctie nasolabiaalplooien en bij patiënten met littekens na 7 en 12 maanden na de derde transplantatie van autologe fibroblasten. Volgens flowcytometrie produceerden gekweekte fibroblasten een grote hoeveelheid Type I-collageen. In vitro-onderzoeken tonen de normale contractiliteit van injecteerbare fibroblasten. Twee maanden na subcutane toediening van gekweekte fibroblasten in een dosis van 4 x 107 cellen werden naakte muizen niet gedetecteerd. Injecteerbare fibroblasten veroorzaakten geen littekenvorming en diffuse fibrose bij patiënten. Volgens de auteur zijn de geïmplanteerde autologe fibroblasten in staat constant collageen te produceren, wat een cosmetisch verjongingseffect zal geven. Omdat de levensduur van gedifferentieerde cellen in dit geval beperkt is, zijn fibroblasten van een jonge patiënt effectiever dan die van oudere mensen. In de toekomst wordt verondersteld dat de mogelijkheid van cryopreservatie van een fibroblastkweek van een jonge donor later naar een oudere patiënt zijn eigen jonge cellen transplanteert. Concluderend is het niet helemaal de juiste conclusie dat autologe fibroblasten onder de conditie van hun functionele preservatie het ideale middel zijn om afwijkingen in de zachte weefsels van het gezicht te corrigeren. Tegelijkertijd stelt de auteur zelf vast dat er tijdens het onderzoek ook enkele problematische situaties ontstonden die verband hielden met het gebruik van een autoloog fibroblast-collageensysteem. Het klinische effect was vaak zwakker dan bij het gebruik van rundercollageen, wat teleurstelling veroorzaakte bij patiënten.

Over het algemeen zien de literatuurgegevens over de vooruitzichten op klinisch gebruik van mesenchymale stamcellen er behoorlijk optimistisch uit. Er worden pogingen ondernomen om autologe beenmerg multipotente mesenchymale progenitorcellen te gebruiken voor de behandeling van degeneratieve gewrichtslaesies. De eerste klinische proeven van gekweekte mesenchymale voorlopercellen in de behandeling van complexe botbreuken worden uitgevoerd. Autologe en allogene mesenchymale stromale beenmergcellen gebruikt om kraakbeenweefsel voor transplantatie bij de correctie van het articulaire kraakbeen defecten als gevolg van trauma of autoimmune laesies genereert. Beoefend methodes van klinische toepasbaarheid van multipotente mesenchymale stamcellen om botdefecten bij kinderen met ernstige osteogenesis vooruitgang veroorzaakt door mutaties van het type I collageen gen te corrigeren. Na mieloabelyatsii kinderen-ontvangers van getransplanteerde beenmerg van HLA-compatibele gezonde donor niet gefractioneerd beenmerg voldoende mesenchymale stamcellen bevatten ernstige botdefect vullen. Na transplantatie van allogene beenmerg hadden dergelijke kinderen positieve histologische veranderingen in trabeculaire botten, een toename van de groeisnelheid en een afname in de incidentie van botbreuken. In sommige gevallen wordt een positief klinisch resultaat bereikt door het transplanteren van nauw verwant allogene beenmerg en osteoblasten. Voor de behandeling van aangeboren fragiliteit van botten als gevolg van onbalans van osteoblasten en osteoclasten in botweefsel, wordt ook MSK-transplantatie gebruikt. Restauratie van botvorming wordt in dit geval bereikt door chimerisatie van de pool van stromale stamcellen en progenitorcellen in het botweefsel van patiënten.

De methoden voor genetische modificatie van donor-mesenchymale stamcellen worden verbeterd om genetische defecten van stromale weefsels te corrigeren. Er wordt verondersteld dat mesenchymale stamcellen binnenkort zal worden gebruikt in de neurologie voor gerichte chimerisatie hersencellen en het creëren van een pool van gezonde cellen, die in staat is het genereren van een tekort enzym of factor die verantwoordelijk is voor de klinische verschijnselen van de ziekte. Transplantatie van mesenchymale stamcellen kan worden gebruikt om beenmergstroma te herstellen bij kankerpatiënten na radio- en chemotherapie, en in combinatie met beenmergcellen - om hemopoëse te herstellen. Ontwikkeling van substitutietherapie gericht op het elimineren van de gebreken van het bewegingsapparaat via MSC's bevorderen techniek in het ontwerpmatrix biomaterialen of biomimics vormen skeletten bevolken het nageslacht van mesenchymale stamcellen.

Bronnen van mesenchymale stamcellen

De belangrijkste bron van mesenchymale stamcellen is beenmerg hematopoietische stamcellen die in zoogdieren voortdurend differentiëren in bloedcellen en het immuunsysteem, terwijl de mesenchymale stamcellen gepresenteerd kleine populaties van fibroblast-achtige beenmerg stromale cellen en helpen de gedifferentieerde toestand van de hematopoëtische stamcellen. Onder bepaalde omstandigheden differentiëren mesenchymale stamcellen tot cellen van kraakbeen- en botweefsel. Wanneer uitgeplaat op een kweekmedium lage dichtheid mononucleaire planten beenmerg stromale cellen vormen kolonies van hechtende cellen, die in feite zijn fibroblast multipotente mesenchymale voorlopercellen. Sommige auteurs hebben gesuggereerd dat beenmerg gedeponeerd gecommitteerde mesenchymale stamcellen, die, dankzij de mogelijkheid om zichzelf te vernieuwen en te hoge differentiatie potentieel, bieden alle weefsels van het lichaam voorgangers mesenchymale stromale cellen in de hele organisme leven van zoogdieren.

In het beenmerg vormen stromale celelementen een netwerk dat de ruimte vult tussen sinusoïden en botweefsel. Het gehalte aan slapende MSC in het beenmerg van een volwassene is vergelijkbaar met het aantal hematopoëtische stamcellen en bedraagt niet meer dan 0,01-0,001%. Mesenchymale stamcellen die zijn geïsoleerd uit beenmerg en die niet zijn onderworpen aan kweken zijn verstoken van adhesieve moleculen. Dergelijke MSC's brengen CD34, ICAM, VCAM, type I en III collageen, CD44 en CD29 niet tot expressie. Daarom, in vitro mesenchymale stamcellen zijn niet gefixeerd op het kweeksubstraat en geavanceerdere progenitor afgeleide mesenchymale stamcellen zijn de cytoskeletcomponenten en receptor volgens celadhesiemoleculen gevormd. Stromale cellen met het fenotype CD34 worden zelfs in perifeer bloed gevonden, hoewel ze veel minder in het beenmerg zijn dan CD34-positieve mononucleaire cellen. De CD34-cellen die uit het bloed zijn geïsoleerd en in de kweek zijn overgebracht, hechten zich aan het substraat en vormen kolonies van fibroblastachtige cellen.

Het is bekend dat in de embryonale periode de stromale basis van alle organen en weefsels van zoogdieren en mensen voortkomt uit een gemeenschappelijke poel van mesenchymale stamcellen vóór en in het stadium van de organogenese. Daarom wordt aangenomen dat in een volwassen lichaam de meeste mesenchymale stamcellen zich in bindweefsel en botweefsel moeten bevinden. Er is vastgesteld dat de meerderheid van de cellulaire elementen van het stroma van los bindweefsel en botweefsel worden vertegenwoordigd door gecommitteerde voorlopercellen, die echter het vermogen behouden om te prolifereren en klonen in vitro te vormen. Met de introductie van dergelijke cellen in de totale bloedstroom worden meer dan 20% van de mesenchymale voorlopercellen geïmplanteerd tussen de stromale elementen van het hematopoietische weefsel en de parenchymale organen.

Een potentiële bron van mesenchymale stamcellen vetweefsel, waaronder toegewijde stamcellen in verschillende mate van adipocyten voorlopers. Tenminste mature progenitorcellen elementen van vetweefsel - stromale-vasculaire cellen, die dezelfde is als multipotente mesenchymale voorlopercellen van beenmerg differentiëren tot adipocyten kan onder de werking van glucocorticoïden, insuline-achtige groeifactor en insuline. In de cultuur van stromale vasculaire cellen differentiëren tot adipocyten en chondrocyten en vetweefsel beenmerg afgeleide cellen vormen adipocyten en osteoblasten.

In de spieren werden stromale stambronnen ook gevonden. De primaire kweekcellen geïsoleerd uit humane skeletspier, onthult stervormige cellen en meerkernige myotubes. In aanwezigheid van paardenserum stellaatcellen prolifereren in vitro zonder tekenen van cytodifferentiation en na de toevoeging van dexamethason aan het kweekmedium van differentiatie wordt gekenmerkt door het verschijnen van celelementen cellen met het fenotype van skeletspieren en gladde spieren, botten, kraakbeen en vetweefsel. Bijgevolg is in menselijk spierweefsel voorgesteld als de al dan niet toegewezen multipotente mesenchymale voorlopercellen. Aangetoond wordt dat een populatie van progenitorcellen aanwezig in de skeletspier afkomstig van niet-vastgelegde multipotente beenmerg mesenchymale progenitorcellen, en verschilt van myogene satellietcellen.

In het myocardium van pasgeboren ratten vond ook lijm stellaatcellen geschikt zijn voor de differentiatie potentieel van multipotente mesenchymale progenitorcellen, zoals onder invloed van dexamethason ze differentiëren tot adipocyten, osteoblasten, chondrocyten, gladde spiercellen, myotubes van skeletspier en cardiale myocyten. Er is aangetoond dat vasculaire gladde spiercellen (pericyten) afgeleid multipotente perivasculaire gedifferentieerde mesenchymale voorlopercellen. In de cultuur van perivasculaire mesenchymale stamcellen tot expressie brengen van een gladde spier actine en plaatjes afgeleide groeifactorreceptor en kunnen tenminste gladde spiercellen differentiëren.

Een speciale plaats, in termen van stamreserves, is het kraakbeenweefsel, waarvan wordt aangenomen dat het extreem lage herstelvermogen te wijten is aan een tekort aan multipotente mesenchymale voorlopercellen of differentiatie- en groeifactoren. Aangenomen wordt dat de multipotente mesenchymale voorlopercellen die vooraf zijn gedoneerd aan de chondro- en osteogenese het kraakbeenweefsel van andere weefselbronnen binnenkomen.

Weefseloorsprong en voorwaarden voor de commissie van mesenchymale progenitorcellen in de pezen zijn ook niet vastgesteld. Ekspermentalnye waarnemingen suggereren dat vroege postnatale konijn achillespees cellen in primaire culturen in de eerste doorgang en de expressie van collageen type I en decorine behouden, maar bij verder kweken ze verliezen tenotsitov differentiatiekenmerken.

Opgemerkt wordt dat het antwoord op de vraag of daadwerkelijk gelokaliseerd in verschillende weefsels van multipotente mesenchymale progenitorcellen zijn altijd aanwezig in de stroma, of weefselpool van mesenchymale stamcellen wordt gecompenseerd door migratie van stromale beenmergstamcellen, is nog verwacht.

Ook het beenmerg en andere mesenchymale weefsels zones adult andere bron van MSC's kunnen navelstrengbloed zijn. Het is aangetoond dat umbilical ader navelstrengbloed bevat cellen die gelijkaardig morfologische en antigene kenmerken multipotente mesenchymale stamcellen moet in staat zijn adhesie, en niet onderdoen multipotente mesenchymale stamcellen van het beenmerg oorsprong door een onderscheid te potentieel. In kweken van mesenchymale stamcellen van navelstrengbloed gedetecteerd 5-10% vastgelegde multipotente mesenchymale voorlopercellen. Het bleek dat hun aantal in het navelstrengbloed is omgekeerd evenredig met de zwangerschapsduur, wat indirect bewijs van de migratie van multipotente mesenchymale progenitorcellen in verschillende weefsels tijdens de foetale ontwikkeling. Er werden eerst informaties klinische toepassing van de mesenchymale stamcellen uit navelstrengbloed, evenals embryo afgeleide biomateriaal, dat gebaseerd is op de bekende vermogen van foetale stamcellen integreren en functie prizhivlyatsya in organen en weefselsystemen volwassen ontvangers.

De zoektocht naar nieuwe bronnen van mesenchymale stamcellen

Het gebruik van mesenchymale stamcellen van embryonale oorsprong, zoals andere foetale cellen, creëert een aantal ethische, wettelijke, juridische en wetgevende problemen. Daarom gaat de zoektocht naar extraembryonaal cellulair donormateriaal gewoon door. Is mislukt klinische toepassing van de menselijke huid fibroblasten, werd vastgesteld, niet alleen door de hoge financiële draagkracht van de technologie, maar ook snelle differentiatie van fibrocytes in fibroblasten met aanzienlijk minder potentiële proliferatie en het produceren van een beperkt aantal groeifactoren. Verdere vooruitgang bij het bestuderen van de biologie van MSK en multipotente mesenchymale beenmergprecursors maakte de ontwikkeling van een strategie voor het klinische gebruik van autologe mesenchymale stamcellen mogelijk. De technologie van hun isolatie, teelt, ex vivo reproductie en gerichte differentiatie vereist, allereerst, de studie van het moleculaire merkerspectrum van MSC's. Hun analyse toonde aan dat er in de primaire culturen van humaan botweefsel verschillende soorten multipotente mesenchymale voorlopercellen zijn. Het pro-osteoblast fenotype werd gevonden in cellen die een marker van stromale precursorcellen STRO-1 tot expressie brengen, maar die geen osteoblastmarker dragen - alkalische fosfatase. Dergelijke cellen worden gekenmerkt door een laag vermogen om een gemineraliseerde botmatrix te vormen, evenals de afwezigheid van expressie van osteopontine en de parathyroïde hormoonreceptor. Derivaten van STRO-1-positieve cellen die geen alkalische fosfatase tot expressie brengen worden weergegeven door intermediaire en volledig gedifferentieerde osteoblasten. Er is vastgesteld dat de cellulaire elementen van gekloneerde lijnen van STRO-1-positieve cellen van menselijke trabeculaire botten zich kunnen differentiëren tot rijpe osteocyten en adipocyten. De richting differentiatie van deze cellen is afhankelijk van de blootstelling van meervoudig onverzadigde vetzuren, pro-inflammatoire cytokines - IL-1b en tumornecrosefactor a (TNF-a), en anti-inflammatoire en immunosuppressieve TGF-b.

Later bleek dat multipotente mesenchymale precursorcellen missen specifiek zijn voor alleen deze inherente fenotype, maar drukken complex markers, kenmerkend voor mesenchymale, endotheel-, epitheel- en spiercellen in de afwezigheid van expressie van hematopoietische cellen immuunfenotypische antigenen - CD45, CD34 en CD14. Bovendien, mesenchymale stamcellen en constitutief induceerbare wijze produceren hematopoietische en niet-hematopoietische groeifactoren, interleukines, en chemokinen, en multipotente mesenchymale precursorcellen expressie receptoren voor bepaalde groeifactoren en cytokinen. Onder stromale cellen basisprincipes van het menselijk lichaam gevonden dormantnye of rustende cellen met immunofenotype, bijna identiek aan de antigene profiel van ruw 5-fluoruracil multipotente mesenchymale progenitorcellen - deze en andere cellen tot expressie CD117, markering "volwassen" stamcellen.

Aldus is een celmarker die uniek is voor mesenchymale stamcellen nog niet vastgesteld. Aangenomen wordt dat rustende cellen vastgelegde populaties van multipotente mesenchymale voorlopercellen omdat zij niet celmarkers toegewijde expressie artrose (Cbfa-1) of adipogenese (PPAR-y-2). De langdurige blootstelling van langzaam prolifererende rustende cellen aan foetaal kalfsserum leidt tot de vorming van terminaal gedifferentieerde voorlopers, gekenmerkt door snelle groei. De klonale groei van dergelijke stammesenchymcellen wordt ondersteund door FGF2. Het blijkt dat het genoom afgeleide stromale stamcellen "gesloten" strak genoeg is gerapporteerd over de afwezigheid van spontane differentiatie van MSC's -. Zonder speciale voorwaarden voor het plegen zelfs zij niet geconverteerd in cellen van mesenchymale series.

De bevolkingsstructuur afgeleide mesenchymale stamcellen worden doorzocht differentiatiemerker eiwitten op de stromale cellijnen en primaire kweken bestuderen. In klonale kolonieproefmedium beenmergcellen in vitro gevonden dat wanneer onderworpen aan primaire kweken van EGF verhoogt de gemiddelde grootte van de kolonies en vermindert klonale expressie van alkalische fosfatase, terwijl de toevoeging van hydrocortison expressie van alkaline fosfatase, dat een merker van osteogene differentiatie van MSCs oriëntatie activeert. Monoklonale antilichamen tegen STRO-1 maakte het mogelijk te scheiden en onderzoekspopulaties van STRO-1-positieve hechtende cellen in een heterogeen systeem Dexter culturen. Het spectrum van cytokines regelen niet alleen de proliferatie en differentiatie van hematopoietische en lymfoïde cellen, maar ook deelnemen aan de formatie, de vorming en resorptie van skeletweefsel door para-, auto- en endocriene mechanismen. Receptor-gemedieerde afgifte van secundaire messengers, zoals cAMP, diacylglycerol, inositoltrifosfaat en Ca2 + worden ook gebruikt voor marker analyse van verschillende soorten weefsels stromale cellen die de relevante receptoren. Het gebruik van monoklonale antilichamen als markers maken stromale lymfoïde organen behoren reticulaire cellen voor T- en B-afhankelijke zones stellen.

Gedurende enige tijd gingen wetenschappelijke geschillen voort over de kwestie van de mogelijkheid van de oorsprong van MSC uit de hematopoietische stamcel. Inderdaad, met de explantatie van de suspensie van beenmergcellen in monolaagkweken, groeien er discrete kolonies van fibroblasten in. Echter, is gebleken dat de aanwezigheid van voorlopers van fibroblast kolonies en verschillende kiemen differentiatie van hematopoietische weefsels als deel van het beenmerg is geen bewijs van hun gemeenschappelijke oorsprong van hematopoietische stamcellen. Discriminantanalyse behulp van beenmergstamcellen gevonden dat de micro-omgeving op heterotopische transplantatie hematopoietische cellen van het beenmerg wordt overgedragen, waarbij het bestaan blijkt in het beenmerg onafhankelijk van histogenetic MSC populatie van hematopoietische cellen.

Bovendien selectieve klonering werkwijze geopenbaard monolayer kweken van beenmerg stromale cellen van een nieuwe categorie precursorcellen hun aantal te bepalen, hun eigenschappen, proliferatieve en differentiatiepotentiaal bestuderen. Gevonden werd dat in vitro fibroblastachtige stromale cellen prolifereren en vormen diploïde kolonies dat wanneer omgekeerde transplantatie in het lichaam zorgen voor de vorming van nieuwe bloedvormende organen. De resultaten van onderzoeken van afzonderlijke klonen geven aan dat er een populatie van cellen in hun proliferatieve en differentiatie potentieel in staat om de rol van stamcellen van het stromaweefsel, Gistogeneticheskaja onafhankelijk van hematopoietische stamcellen in de stromale stamcellen krijgen. Cellen van deze populatie worden gekenmerkt door zelfdragende groei en differentiëren tot voorlopercellen van bot-, kraakbeen- en reticulair beenmergweefsel.

Van groot belang zijn de resultaten van studies Chailakhyan R. Et al (1997-2001), die gekweekt beenmerg afgeleide stromale stamcellen konijnen, cavia's en muizen van een MEM-kweekmedium aangevuld met foetaal kalfsserum was. De auteurs voerden de explantatie uit met een aanvankelijke dichtheid van 2-4 x 103 beenmergcellen per 1 cm2. Als een toevoerinrichting werden homologe of heterologe door straling geïnactiveerde beenmergcellen gebruikt in een dosis die de toevoerwerking handhaafde maar hun proliferatie volledig blokkeerde. Tweewekelijkse primaire afzonderlijke kolonies van fibroblasten werden getrypsiniseerd om monoklonale stammen te produceren. Evidence klonale oorsprong kolonies werden verkregen met behulp van chromosomale merkers in gemengde culturen van beenmerg van mannelijke en vrouwelijke cavia's, time-lapse-opnamen levende culturen, maar ook in gemengde culturen van beenmerg van syngene muizen en CBA SVAT6T6. Transplantatie suspensie van vers geïsoleerde beenmergcellen gekweekt in vitro of stromale fibroblasten onder de renale capsule werd op ivalonovyh poreuze scaffolds of gelatine, alsook geïnactiveerde konijn poreus bot matrix. Transplantatie klonen in het bot deksel dijen cavia schoongemaakt van zacht weefsel en beenvlies, snijd de epifyse en grondig wassen van het beenmerg. Het bot werd in fragmenten gesneden (3-5 mm), gedroogd en bestraald met een dosis van 60 Gy. In de beenderhoezen werden individuele fibroblastkolonies geplaatst en intramusculair geïmplanteerd. Voor intraperitoneale transplantatie van de stromale fibroblasten gekweekt in vitro, gebruikten we typen A diffusiekamer (V = 0.015 cm3, h = 0, l mm) en D (V = 0,15 cm3, h = 2 mm).

Bij het bestuderen van de dynamiek van de groei van klonale stammen Chailakhyan R. Et al (2001) vonden dat de individuele cellen, kolonievormende fibroblasten, evenals hun nakomelingen hebben grote proliferatief potentieel. Bij de 10e passage was het aantal fibroblasten in sommige stammen 1,2-7,2 x ¹⁰⁹ cellen. Tijdens hun ontwikkeling presteerden ze tot 31-34 celduplicaties. Aldus heterotopische transplantatie van beenmerg afgeleide stammen gevormd door stromale precursors enkele tientallen klonen leidde tot de overdracht van beenmerg micro en onderwijs in de nieuwe zone hematopoëtische orgaantransplantatie. De auteurs verhoogde de vraag of individuele klonen beenmergmicromilieu stromale cellen kunnen tolereren, of het vereist de medewerking van verschillende klonogene stromale voorlopercellen? En als afzonderlijke klonen in staat zal zijn om de micro-omgeving over te dragen, of het is vol van alle drie de kiem bloed, of verschillende klonen zorgen voor de vorming van haematopoietische micro-omgeving voor verschillende kiemen? Om deze problemen aan te pakken is ontwikkeld technologie van de teelt stromale voorlopercellen in het collageen gel die u toelaat om te schieten van het oppervlak van fibroblasten gegroeid kolonies voor de volgende heterotopische transplantatie. Afzonderlijke klonen stromale fibroblasten, beenmergcellen gekweekt uit CBA muizen en cavia's, uitgesneden samen met een fragment van de gelcoat en getransplanteerd heterotope - onder de nier capsule van syngene muizen of autologe spierbuik cavia's. Bij transplantatie in de spier werden de kolonies op de gel in de benige deksels geplaatst.

We hebben ontdekt dat door 50-90 dagen na transplantatie van beenmerg fibroblast kolonie in 20% van de gevallen werden waargenomen bij de transplantatie gebiedsontwikkeling van bot of bot en hematopoietische weefsel. Bij 5% van de ontvangende dieren bevatten de foci van gevormd botweefsel een holte gevuld met beenmerg. Binnen bot cilinders dergelijke foci een afgeronde vorm en een capsule vervaardigd van botweefsel, met osteocyten en goed ontwikkelde osteoblastische laag. Beenmerg holte bevat reticulaire stof met myeloïde en erythroïde cellen, de hoeveelheden die niet verschillen van die in de normale beenmerg. De niertransplantaat was een typisch medullaire lichaam die uit natief beenmergtransplantatie, waarbij bot capsule omvat alleen de mergholte van de renale capsule. Hooded-weefsel omvatte myeloïde, erytroïde en megakaryocytische elementen. Het stroma van de medullaire holte had een goed ontwikkeld sinussysteem en bevatte typische vetcellen. Op hetzelfde moment op het gebied van transplantatie van sommige kolonies bot met geen tekenen van hematopoiese werd gevonden onder de nier capsule. Studie van proliferatie en differentiatie sterkte van afzonderlijke klonen werden continu op monoklonale konijn beenmerg stammen, de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in kweekmedium en in een aparte ivalonovoy spons gewicht van 1-2 mg verscholen onder de nier capsule van het konijn beenmerg donor. Een dergelijke autotransplantatie werd onderworpen aan de cellen van 21 monoklonale stammen. De resultaten werden in 2-3 maanden in aanmerking genomen. De auteurs vonden dat 14% van de getransplanteerde beenmerg monoklonale stammen gevormde voorwerp uit bot en merg gevulde holte met hematopoïetische cellen. In 33% van de gevallen gevormd getransplanteerde stammen compacta met verschillende grootte holten ostootsitami ingemetseld osteoblastische en ontwikkelde laag. In sommige gevallen, sponzen getransplanteerd klonen ontwikkeld reticulum zonder been of hematopoietische cellen. Soms reticulaire formatie stroma optrad met een goed ontwikkeld netwerk van sinusoïden, maar niet bevolkt hematopoietische cellen. Aldus waren de verkregen resultaten vergelijkbaar met die verkregen bij de transplantatie van klonen op een collageengel. Indien de klonen transplantatie gegroeid op het substraat resulteerde in de vorming van beenmerg weefsel 5% van het bot - 15% en het reticulaire stof - in 80% van de gevallen, de transplantatie monoklonale stammen vorming van beenmergcellen werd waargenomen bij 14% van de gevallen been - in 53% en reticulair - in 53% van de gevallen. Volgens de auteurs, betekent dit dat de voorwaarden voor de uitvoering van de proliferatie en differentiatie potentieel van stromale fibroblasten wanneer getransplanteerd op poreuze stellages waren optimaler dan bij de transplantaties in bot en bedekt de collageensubstraat. Het is niet uitgesloten dat het gebruik van meer geavanceerde methoden van de teelt en de transplantatie van klonen feedback aan de voorwaarden voor de uitvoering van zijn klonen differentiatie potentieel kan verbeteren en deze relaties te veranderen. Hoe dan ook, maar de hoofdwaarde van het onderzoek is het feit dat sommige klonen stromale cellen kunnen vormen botweefsel tegelijkertijd stromale hematopoïetische micromilieu onmiddellijk drie spruiten van beenmerg bloed erytroïde, myeloïde en megakaryotische, waardoor een groot genoeg steunpunten hematopoïetische weefsels en wat botmassa.

Verder hebben de auteurs het probleem opgelost van het vermogen van deze typen celdifferentiatie van individuele klonale stromale voorlopercellen in omstandigheden van een gesloten systeem van diffusiekamers. Verder moet worden uitgemaakt was of afzonderlijke klonen van pluripotente vertonen of display voor differentiatie potentieel van de coöperatieve interactie van verscheidene klonen met een vast teken cytodifferentiation vereist verschillende verhouding die bepaalt de algemene vorming van bot, kraakbeen of reticulaire. Door het combineren van twee methodologische benaderingen - monoklonale isoleert beenmerg stromale voorlopercellen en transplantatie ze in de diffusiekamers, Chailakhyan R. Et al (2001) verkregen resultaten die toegestaan om het begrip van de structurele organisatie van het beenmerg stroma te benaderen. Transplantatie monoklonale stammen stromale stamcellen in Type O cellen resulteerde in de vorming van zowel bot en kraakbeen, die het vermogen aantonen van de nakomelingen van één kolonievormende stromacellen het gelijktijdig vormen van bot en kraakbeen. De aanname dat bot en kraakbeenweefsel zijn oorsprong vindt in de gemeenschappelijke stromale voorlopercellen, is herhaaldelijk herhaaldelijk tot uitdrukking gebracht. Deze hypothese had echter geen correcte experimentele bevestiging. De vorming van bot en kraakbeen in diffusiekamers was een noodzakelijk bewijs van het bestaan tussen stamcellen van het beenmergstroma van een gemeenschappelijke precursorcel voor deze twee soorten weefsel.

Dan 29 klonale stammen, tweede en derde doorgangen kunnen primaire kweken afgeleid van het beenmerg van het konijn werden in diffusiekamers gebracht en intraperitoneaal geïmplanteerd homologe dier. Studies hebben aangetoond dat 45% van de beenmergmonoklonale stammen osteogene potenties hebben. Bij wijze van uitzondering bevatte het reticulaire weefsel 9 kamers, maar samen met bot en kraakbeenweefsel was het aanwezig in 13 andere kamers, die 76% van alle stammen vertegenwoordigden. In kamers van type O, waar differentiatie mogelijk was voor zowel bot- als kraakbeenweefsel, werden 16 stammen bestudeerd. In vier kamers (25%) werden zowel bot- als kraakbeenweefsel gevormd. Er wordt nogmaals op gewezen dat de studies Chailakhyan R. Et al (2001) individuele progenitorcellen ondergingen cellijn bestaande uit 31-34 verdubbelingen en hun nageslacht was 0,9-2,0 x 10 ⁹ cellen. Het aantal mitosen waaraan de voorlopercellen van de polyklonale stammen waren blootgesteld was praktisch hetzelfde als dat van de cellen van de monoklonale stammen. Tegelijkertijd was de snelheid van ontwikkeling van polyklonale stammen, vooral in de eerste fase van hun vorming, in aanzienlijke mate afhankelijk van het aantal kolonies dat werd gebruikt voor het initiëren van stammen. Diploïde stammen van humane embryonale fibroblasten (WI-38), wanneer opnieuw gevormd op 12-15 duplicatieniveaus van duplicatie, vormden ook kolonies die verschillen in diameter en in het gehalte aan cellen daarin. Grote kolonies met meer dan 103 cellen waren slechts 5-10%. Met de toename van het aantal divisies nam het percentage grote kolonies af. De mono- en polyklonale beenmerg stromale fibroblasten stammen behield diploïde chromosoom set na 20 of meer verdubbelingen en ontwikkelingstendens was vergelijkbaar met de dynamiek van diploïde stammen embryonale fibroblasten. Analyse van het differentiatiepotentieel van individuele beenmergstromale voorlopercellen, uitgevoerd door het transplanteren van monoklonale stammen in diffusiekamers, toonde aan dat de helft van hen osteogeen is. Grote kolonies vertegenwoordigden 10% van hun totale aantal. Bijgevolg kwam het aantal osteogene kolonievormende cellen overeen met ongeveer 5% van hun totale populatie. In de totale massa van osteogene progenitorcellen geïdentificeerd door de auteurs, waren er cellen die in staat waren om gelijktijdig bot- en kraakbeenweefsel te vormen. Voor het eerst vond dat voor deze twee soorten weefsels in het volwassen organisme een gemeenschappelijke voorlopercel: 25% van de geteste klonen werden door vergelijkbare cellen en hun aantal in de algemene populatie van voorlopercellen is niet minder dan 2,5%.

Aldus heeft heterotope transplantatie van individuele klonen van beenmergfibroblasten nieuwe aspecten van de structurele organisatie van de populatie van mesenchymale voorlopercellen geopend. In totaal stromale stamcellen in staat is om specifieke micromilieu onmiddellijk voor hemopoietische stamcellen welk nummer van de onderzochte klonen groter op verschillende modellen van 5 tot 15% (0,5-1,5% van het totale aantal progenitorcellen gedetecteerd). Naast de klonen, overdragen volledige beenmergmicromilieu, er progenitorcellen, deterministische alleen botvorming, welke vorm bij overbrenging naar een open systeem, het bot dat niet de ontwikkeling van hematopoiese. Hun aantal van het totale aantal progenitorcellen is 1,5-3%. Sommige van deze cellen kunnen botweefsel vormen met een beperkte periode van zelfhandhaving. Bijgevolg is de populatie van stromale voorlopercellen heterogeen in zijn differentiatiepotentieel. Onder hen is er een categorie cel aanspraak maken op de rol van stromale stamcellen kunnen differentiëren tot drie dimensies inherente beenmerg stromale weefsel, vorming van bot, kraakbeen en reticulaire weefsel. Deze gegevens kunnen we hopen dat met de hulp van verschillende cel markers mogelijk zal zijn om de bijdrage van elk type stromale cellen in het micromilieu van de specifieke organisatie te bepalen en te ondersteunen hematopoiese in Dexter culturen.

Kenmerken van mesenchymale stamcellen

De laatste jaren is gevonden dat in stationaire kweken van beenmerg mesenchymale multipotente progenitorcellen gepresenteerd een beperkte populatie van kleine granulaire cellen (RS-1) cellen, gekenmerkt door het lage vermogen van kolonisatie en afwezigheid van Ki-67 antigeen expressie specifiek voor prolifererende cellen. Antigene parameters dormantnyh RS-1 cellen verschillen van het spectrum van toegewijde antigenen snel prolifererende stromale stamcellen. Gevonden werd dat een hoge mate van proliferatie van gecommitteerde progenitorcellen alleen in de aanwezigheid van RS-1 cellen waargenomen. Op zijn beurt, RS-1 cellen verhoogt de snelheid van groei onder invloed van factoren afgescheiden door de volwassen afgeleide multipotente mesenchymale progenitorcellen. Het lijkt erop dat de RS-1-cellen zijn een subset van niet-gecommitteerde MSC staat recycling. In vitro resistent tegen 5-fluorouracil stromale stamcellen van het beenmerg gekenmerkt door een lage RNA-gehalte en een hoog niveau van expressie van ornithine decarboxylase gen - marker niet-prolifererende cellen.

Intensieve reproductie van stromale voorlopercellen begint na fixatie op het substraat. Wanneer deze tot expressie wordt gebracht merkerprofiel van slecht gedifferentieerde cellen: SH2 (TGF- receptor (3), SH3 (domein signaleringeiwit), collageen typen I en III, fibronectine, adhesiereceptor VCAM-1 (CD106) en ICAM (CD54), cadherine-11 , CD44, CD71 (transferrine receptor), CD90, CD120a en CD124, zonder expressie van karakteristieke merkers van hematopoietische stamcellen (CD34, CD14, CD45). Klonale groei maakt herhaaldelijk aan passage onderworpen mesenchymale stamcellen een cultuur van vele genetisch homogene stromale voorlopercellen pluripotente produceren cellen. Cerea 2-3 de doorgang van hen bereikt 50-300,000,000. In de cultuur van voldoende dichtheid na het stoppen van de proliferatie van stromale stamcellen, in tegenstelling hematopoietische weefsel fibroblasten differentiëren tot adipocyten, myocyten, kraakbeencellen en botweefsel. De combinatie van de drie differentiatie reguleringssignalen omvattende 1-methyl-izobutilksantin (inductor van intracellulaire cAMP-vorming), dexamethason (een remmer van fosfolipase a en C) en indomethacine (een cyclooxygenaseremmer, tromboxaan verlagende activiteit en) draait in adipocyten tot 95% van de mesenchymale stamcellen. Adipocyten vorming van onrijpe stromale cellen bevestigde de expressie van lipoproteïne lipase-gen, histochemische identificatie van apolipoproteïnen en peroxysomal receptoren. De cellen van dezelfde kloon onder invloed van TGF-b in een serumvrij medium vormen een homogene chondrocytenpopulatie. Meerlaagse celkweek kraakbeen extracellulaire matrix gekenmerkt wordt ontwikkeld uit proteoglycan en collageen type II. De voedingsbodem met 10% foetaal effect differentiatiesignalen complex van b-glycerofosfaat (gever anorganisch fosfaat), ascorbinezuur en dexamethason, in dezelfde cultuur stromale voorlopercellen stamcellen leidt tot de vorming van celaggregaten. In dergelijke cellen, is er een geleidelijke toename van de activiteit van alkalische fosfatase en osteopontine niveau, hetgeen de vorming van botmineralisatie welke cellen bevestigde een progressieve toename in intracellulair calcium.

Volgens sommigen het vermogen van mesenchymale stamcellen tot onbeperkt delen en reproduceren van verschillende soorten mesenchymale afkomstcellen combinatie met een hoge mate van plasticiteit. Indien toegediend in de ventrikels of witte stof mesenchymale stamcellen migreren in het parenchym van het zenuwweefsel en differentiëren tot neuronale of gliale cellijn. Bovendien is er informatie over MSC transdifferentiatie in hematopoietische stamcellen zowel in vitro en in vivo. Een meer diepgaande analyse sommige studies bepaald uitzonderlijk hoge ductiliteit van MSCs, die tot uiting in hun vermogen om te differentiëren tot astrocyten, oligodendrocyten, zenuwcellen, cardiomyocyten, gladde spiercellen en skeletspiercellen. In een aantal studies transdifferentsirovochnogo potentieel van MSCs in vitro en in vivo gevonden dat multipotente mesenchymale voorlopercellen van beenmerg oorsprong terminaal differentiëren in cellijnen die bot, kraakbeen, spier, zenuw en adipose weefsel te vormen, alsmede pezen en het stroma dat hematopoiese ondersteunt .

In andere studies, geen tekenen van beperking pluripotentie genoom van mesenchymale stamcellen en kon niet worden gedetecteerd stromale voorlopercelpopulaties, maar mogelijk pluripotente stromale cellen onderzocht meer dan 200 MSC klonen geïsoleerd uit een primaire kweek te controleren. De overgrote meerderheid van klonen in vitro behield het vermogen om te differentiëren in de osteogene, chondrogene en adipogene richtingen. Genormaliseerd voor de waarschijnlijkheid van migratie van de ontvangende cellen door transplantatie van mesenchymale stamcellen onder de nier capsule of diffusiekamers bleek dat stromale voorlopercellen in situ handhaven heterogene fenotype, waarbij ofwel de afwezigheid van een zone transplantaat restrictiefactoren of afwezigheid van pluripotente MSCs alleen aangeeft. Tegelijkertijd mag het bestaan van een zeldzame vorm van somatische pluripotente stamcellen, die gemeenschappelijk voorlopers van volwassen stamcellen.

Aan multi-, maar niet zo pluripotente mesenchymale stamcellen slechts een zeer kleine fractie van beenmergcellen en kunnen onder bepaalde omstandigheden, wanneer gekweekt in vitro te prolifereren zonder in differentiatie, zoals blijkt uit hun geïnduceerde lineage inzet van cellen in bot, kraakbeen, vet, spierweefsel , evenals in de tenocyten en stromale elementen die de hematopoëse ondersteunen. Gewoonlijk continue blootstelling in kweekmedium met foetaal kalfsserum veroorzaakt uitgang MSCs in stromale van gecommitteerde progenitorcellen, het nageslacht daarvan ondergaat spontane uiteindelijke differentiatie. In vitro kan directionele osteoblast vorming realiseren door aan het medium conditioneren dexamethason, ß-glycerofosfaat en ascorbinezuur, terwijl de combinatie van dexamethason en differentiatiesignalen insuline induceert de vorming van adipocyten.

Vastgesteld is dat alvorens het stadium van terminale differentiatie van MSCs bepaalde kweekomstandigheden maken aanvankelijk differentiëren tot fibroblast-achtige mesenchymale stamcellen. Derivaten van deze cellen in vivo zijn betrokken bij de vorming van bot, kraakbeen, pezen, vet en spierweefsel alsook stromale ondersteuning hematopoiese. Veel auteurs begrijpen van de term "multipotente mesenchymale stamcellen" als werkelijk MSC's, en de gecommitteerde stromale stamcellen en beenmerg mesenchymale weefsels. Klonale analyse van multipotente mesenchymale progenitorcellen van beenmerg oorsprong bleek dat iets meer dan een derde van de klonen gedifferentieerd osteo-, hondro- en adipocyten, terwijl andere klonen cellen osteogeen potentieel en vormen maar hondro- en osteocyten. Deze kloon van multipotente mesenchymale precursorcellen als IUD-9, onder geschikte omstandigheden micro gedifferentieerd tot cellen met een fenotype en functionele kenmerken niet alleen van osteoblasten, chondrocyten en adic potsitov maar stromale cellen die hematopoiese te ondersteunen. Geïsoleerd uit foetale ratten beenmergcellen kloneren RCJ3.1 gedifferentieerde mesenchymale cellen van verschillende fenotypes. Door de gecombineerde werking van ascorbinezuur, B-glycerofosfaat en dexamethason van cellulaire elementen van deze kloon eerst gevormd veelkernige myocyten en achtereenvolgens adipocyten, chondrocyten en eilandjes gemineraliseerd bot. De populatie van granulaire cellen van het periosteum van ratfoetussen overeenkomt met vastgelegde multipotente mesenchymale progenitorcellen, zoals gekenmerkt door een lage proliferatie, niet markers van differentiatie tot expressie en gedifferentieerd in kweek omstandigheden hondro- vormen, osteo- en adipocyten en gladde spiercellen.

Aldus moet worden onderkend dat de kwestie van de pluripotente of multipotentialiteit van het genoom van mesenchymale stamcellen open blijft, hetgeen dienovereenkomstig het concept van het differentiatiepotentieel van stromale voorlopercellen beïnvloedt, hetgeen ook niet definitief is vastgesteld.

Het experimenteel bewezen en belangrijke kenmerk van mesenchymale stamcellen is hun vermogen om de weefselniche te verlaten en in de algemene bloedbaan te circuleren. Om het genetische differentiatieprogramma te activeren, moeten dergelijke circulerende stamcellen in de juiste micro-omgeving vallen. Er wordt aangetoond dat bij systemische toediening aan de bloedstroom MSC ontvangende dieren onrijpe cellen geïmplanteerd in verschillende organen en weefsels, vervolgens gedifferentieerd in bloedcellen, myocyten, adipocyten, chondrocyten en fibroblasten. Bijgevolg in de lokale weefselgebieden optreedt signaal-regulerende interactie van niet toegewezen stromale stamcellen, en tussen hen en de omringende rijpe cellen. Aangenomen wordt dat de differentiatie-inductie wordt uitgevoerd paracriene regulerende factoren van mesenchymale oorsprong en nemezenhimalnogo (groeifactoren, eicosanoïden, extracellulaire matrix moleculen) die de ruimtelijke en temporele relaties in het micromilieu van multipotente mesenchymale voorlopercellen verschaffen. Daarom moeten lokale beschadiging van mesenchymale weefsels leiden tot de vorming van een micro-zones multipotente mesenchymale precursorcellen kwalitatief verschilt van de complexe regulerende signalen intacte weefsels waarin fysiologische processen plaatsvinden in plaats van herstellende regeneratie. Dit verschil is uitermate belangrijk in termen van de specialisatie van het celfenotype in een normale en door schade geïnduceerde micro-omgeving.

Volgens de ideeën zijn hier de mechanismen van het fundamentele verschil van twee bekende processen - fysiologische regeneratie en inflammatoire proliferatie - gelegd. De eerste eindigt met de restauratie van gespecialiseerde cellulaire weefselsamenstelling en de functie ervan, terwijl het resultaat van het proliferatieproces de vorming is van volwassen bindweefselelementen en verlies van functie van de beschadigde weefselzone. Voor de ontwikkeling van optimale programma's voor het gebruik van multipotente mesenchymale voorlopercellen in regeneratieve plastische geneesmiddelen is een zorgvuldige studie van de kenmerken van de invloed van micro-omgevingsfactoren op de differentiatie van MSC's noodzakelijk.

Afhankelijkheid van de structuur van het compartiment van stamcellen op cellulaire para- en autocriene regulatoren, waarvan de expressie wordt gemoduleerd door externe signalen, niemand twijfelt. Onder de functies van regulerende factoren zijn de belangrijkste de beheersing van asymmetrische deling van MSC's en de expressie van genen die de stadia van commisie bepalen en het aantal celdelingen. Externe signalen, waarvan de verdere ontwikkeling van MSC afhankelijk is, worden geleverd door hun micro-omgeving. Bij onvolgroeide MSCs voldoende tijd vermenigvuldigen, terwijl het vermogen om te differentiëren in adipocyten lijn, myofibroblasten, hematogene stromaweefsel, kraakbeencellen en bot. Het blijkt dat een beperkte populatie van circulerende SB34-negatieve stromale cel elementen uit de bloedsomloop wordt teruggevoerd naar het beenmerg stroma weefsel wordt omgezet in een lijn waar CD34-positieve hematopoietische stamcellen. Deze waarnemingen suggereren dat de recirculatie voorlopercellen mesenchymale cellen in de bloedbaan van het weefsel biedt ondersteuning voor de rest van stromale stamcellen in verschillende organen door het mobiliseren van gemeenschappelijke pool van onrijpe stromale beenmergcellen. Differentiatie van MSCs in cellen met meerdere mesenchymale fenotypen en hun deelname aan het herstel of regeneratie van bot, kraakbeen, pees en vetweefsel in vivo aangetoond door adoptieve overdracht modellen bij proefdieren. Volgens andere auteurs wordt verre migratie van MSC vaatbed gecombineerd met een lokale verplaatsing of korotkodistantnym multipotente mesenchymale voorlopercellen in het weefsel bij het herstel van kraakbeen, spier regeneratie en andere reductiereacties.

Lokale reserves stam stromaweefsel funderingen spelen een rol bron van cellen in een fysiologische processen weefselregeneratie en worden aangevuld door afstand watertransport MSC als uitgaven stromaweefsel stam middelen. In spoedeisende mobilisatie van cellulair herstellende vermogen zoals multiple trauma, in het herstelprocessen regeneratie deel MSC gehele trein en de omtrek via de bloedbaan gerekruteerd mesenchymale voorlopercellen van beenmerg.

Transplantatie van mesenchymale stamcellen

Er zijn bepaalde parallellen tussen de processen van fysiologische regeneratie van weefsels en hun vorming tijdens de periode van intra-uteriene ontwikkeling. De embryogenese van mensen en zoogdieren, de vorming van verschillende soorten gespecialiseerde cellen afkomstig van ecto, meso- en endodermale kiembladen zwembad, maar met de verplichte deelname van de mesenchym. Het losse cellulaire netwerk van embryonaal mesenchymaal weefsel vervult tal van regulerende, metabolische, skeletale en morfogenetische functies. Bookmark voorlopig lichamen pas na het condensatie mesenchym ten koste van de groei klonogene progenitorcellen die primaire morfogenetische signalen genereren organogenese uitgevoerd. Stromaderivaat embryonale mesenchym creëren steiger voorlopig lichamen en vormen de basis van de toekomstige energoplasticheskogo verzekeren als gevolg van de groei van de primaire vasculaire en lymfevaten. Met andere woorden, de stromale elementen van de microcirculatie-eenheid van de foetale organen verschijnen vóór de vorming van hun structureel-functionele eenheden. Bovendien zorgt actieve migratie van mesenchymale cellen tijdens organogenese voor ruimtelijke oriëntatie van zich ontwikkelende organen als gevolg van het markeren van hun volumegrenzen door beperking van homeotische Noch-Teps. Op de stromale scaffold is er ook een verzameling van structurele en functionele eenheden van parenchymateuze organen, die vaak morfogenetisch en functioneel compleet verschillende cellen bevatten. Bij de embryogenese zijn de mesenchymale functies dus primair en worden ze gerealiseerd door het genereren van regulatiesignalen die regionale proliferatie en differentiatie van progenitoriële epitheelcellen activeren. Embryonale mesenchymcellen produceren groeifactoren zoals LEG, HGF-b, CSF, waarvoor parenchymale progenitorcellen overeenkomstige receptoren hebben. De rijpe gedifferentieerde weefsels van het volwassen organisme stromale cel netwerk genereert ook signalen naar de levensvatbaarheid en proliferatie van progenitorcellen te behouden nemezenhimalnogo oorsprong. De spectrum stromale regulerende signalen in postnatale ontogenese andere (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, enz.) En is gericht op het verschaffen van fysiologische regeneratie of reparatie van beschadigde weefselzones. Bovendien zijn de spectrale kenmerken van stromale regulerende factoren in elk soort weefsel en zelfs binnen hetzelfde orgaan verschillend. Vooral hematopoiese en lymfopoiese de vermenigvuldiging en differentiatie van hematopoietische en immunocompetente cellen treedt alleen in bepaalde organen, waarbinnen optreedt stromale micromilieu verschaffen van omstandigheden voor de rijping van hematopoëtische en lymfoïde cellen. Het is aan regulerende factoren micro-omgeving afhankelijk van het vermogen van hematopoietische en lymfoïde cellen om het lichaam weer te bevolken te laten groeien en rijpen in zijn microstructurele niches.

Tussen de componenten van de extracellulaire matrix, die multipotente mesenchymale precursorcellen te produceren, zij opgemerkt fibronectine, laminine, collageen en proteoglycanen, evenals CD44 (hyaluronan en osteopontine receptor) die de hoofdrol in de organisatie van de intercellulaire interacties en vorming van extracellulaire matrix in het beenmerg en bot . Het is bewezen dat het beenmerg mesenchymale, multipotente cellen te creëren redshestvenniki stromale micromilieu, die de inductieve en regulerende signalen alleen de MSC, maar ook hematopoëtische voorlopers en nemezenhimalnye beenmergstamcellen. Het is bekend dat MSCs betrokken bij hematopoiese gemeten door hun vermogen om te differentiëren in stromale cellen die hematopoiese te ondersteunen, waarbij de actieve begeleiding MSK signaal direct afkomstig van hematopoietische stamcellen. Dat is de reden waarom de cultuur van netwerken stromale stamcellen is de basis voor het voederen van alle klonen van hematopoietische cellen.

Bij een volwassen organisme intensiteit van hemodialyse en lymfopoiese in een staat van dynamisch evenwicht met de "kosten" van rijpe bloedcellen en het immuunsysteem in de periferie. Sinds stromale beenmergcellen en lymfoïde organen zelden bijgewerkt, heeft een ingrijpende herstructurering stromale structuren zich niet in hen. Breng het systeem dynamisch evenwicht is mogelijk met behulp van mechanische schade aan organen hemo of lymfopoiese, wat leidt tot dezelfde soort opeenvolgende veranderingen die van invloed niet alleen en niet zozeer van hematopoietische of lymfoïde cellen, stromale structuren beschadigd orgaan. In het proces van herstellende regeneratie voornamelijk gevormd stromale raamwerk, dat vervolgens repopulatie hematopoietische en immuuncellen. Deze lange bekend feit maakt posttraumatische regeneratie handig Modelmatige stromale micromilieu van bloedvormende organen. In het bijzonder voor het onderzoek van herstellende regeneratie van beenmerg wordt gebruikt mechanische ledigen mergholte van pijpbeenderen - curettage, zodat snel en effectief de hematopoietische weefsel te brengen vanuit een staat van dynamisch evenwicht. Bij het bestuderen van het proces van herstellende regeneratie van hematopoietische en stromale beenmergcellen componenten na mechanische lediging van de médullaire holte van de tibia cavia's bleek dat tussen indicatoren regeneratie van hematopoïetische en stromale cellen (het aantal hematopoietische cellen, de concentratie en hoeveelheid stromale stamcellen) geen directe correlatie. Bovendien bleek dat de toename van de populatie van stromale stamcellen treedt op een eerder tijdstip na curettage en zelf stromale fibroblasten fosfatazopolozhitelnymi, die kenmerkend osteogene weefsels. Ook werd vastgesteld dat de curettage 3-5 pijpbeenderen leidt tot de groei van de celpopulatie in het beenmerg en onbediende bot zelfs in de milt, die in cavia slechts lymfopoietische lichaam.

Morfologische foto herstelprocessen in beenmerg kyuretirovannyh tibiale cavia overeenstemmende met literatuurgegevens verkregen bij proeven op dieren van andere soorten, de dynamiek van veranderingen die plaatsvinden na het verwijderen van de hematopoietische weefsel is hetzelfde voor alle soorten en het verschil betreft alleen de tijdparameters . Morfologisch procedurefase voor het herstel van hematopoëse in mergholte wordt geleegd in opeenvolgende processen organiseren bloed stolselvorming grove vezels bot, de resorptie van sinusoïden en reticulaire formatie stroma, welke hematopoïetische elementen verder herbevolken. Het aantal hematopoiëtische progenitorcellen in beenmerg weefsel regeneratie verhogingen parallel verhoging van het gehalte van hematopoietische stamcellen.

Gerasimov Yu et al (2001) vergeleken de veranderingen in het aantal hematopoietische cellen en de hoeveelheid stromale cel precursors in de afzonderlijke fasen van het regeneratieproces. Het bleek dat de kwantitatieve veranderingen in beenmergcellen in het uitgeharde bot overeenkomen met de dynamiek van de morfologische kenmerken van regeneratie. Reductie tijdens de eerste drie dagen van de celinhoud in wedergeboren auteurs schrijven het verlies van hematopoietische cellen als gevolg van de negatieve effecten van de micro-omgeving, wat leidt tot reticulaire weefsel groeit in de resterende beenmerg in de epifyse en in het laatste aan brandpunten osteoid en vasculaire schade met curettage vormen. 7-12 e dag verhogen yaderosoderzhaschih cellen valt samen met het verschijnen van de afzonderlijke foci bij myeloïde hematopoietische cellen stromale proliferatie zones. Op de 20e dag zijn er grote delen van de geregenereerde beenmerg en goed ontwikkeld sinussen, die gepaard gaat met een aanzienlijke toename van de totale aantal cellen. Het aantal hematopoietische elementen in deze periode is echter 68% van het controleniveau. Dit is consistent met eerder gepubliceerde gegevens blijkt dat het aantal bloedvormende cellen na curettage slechts 35-40 dagen na de operatie vereisten voldoet.

In de vroege posttraumatische periode is de belangrijkste cellulaire bron voor het herstel van hemopoiese de cellulaire elementen die in de curettage worden bewaard. In latere bewoordingen zijn de belangrijkste bronnen van regeneratie van het hematopoëtische weefsel van het beenmerg stamcellen die de vrije stromale zones opnieuw bevolken. Wat betreft bepaalde categorieën stromacellen (endotheliaal, reticulair en osteogeen), blijven de bronnen die hun vorming verschaffen tijdens de reconstructie van de medullaire holte onverklaard. De resultaten van Yu.V. Gerasimov en co-auteurs (2001) getuigen dat in het beenmerg bewaard na curettage de concentratie van cellen die fibroblastkolonies vormen significant hoger is dan in het normale beenmerg. De auteurs zijn van mening dat met curettage is intenser selectieve elutie van hematopoietische cellen in vergelijking met stromale kolonievormende cellen die betrokken zijn bij de vorming van stroma en meer vast verbonden met zijn basisstof dan hematopoietische cellen.

De dynamiek van veranderingen in het aantal cellen kolonies fibroblasten correleert met de intensiteit van osteogenese processen latere trabeculair bot resorptie en reticulaire formatie stroma hematopoietische cellen bevolken. De meeste van de stromale voorlopercellen vormen een ruw fibreus botweefsel en een reticulair stroma bij de aangegeven regeneratietijden. Voor fracturen van dijbeen onder omstandigheden van langdurige osteosynthese op de 5e dag in de regeneratiezone verhoogt de concentratie van cellen en het aantal kolonievormende fibroblasten en botvorming op de intensive dat aantal met 6 maal. Het is bekend dat beenmergcellen die fibroblastkolonies vormen osteogene eigenschappen bezitten. Het aantal stromale voorlopercellen neemt toe voor kolonisatie van het gebied van het gecortexeerde beenmerg door hematopoietische cellen. Dit is in goede overeenstemming met het bewijs dat stromale cellen de vorming van een hematopoietische micro-omgeving verschaffen. Uiteraard is het creëren van hematopoïetische micromilieu correspondeert met een bepaald niveau van regeneratie van stromale weefsel, en verhoogt het aantal hematopoëtische cellen bij expansie stromale bruggenhoofd geschikt om hematopoiese.

Van het grootste belang zijn de gegevens van de auteurs dat onmiddellijk na curettage het aantal stromale voorlopercellen in de afgelegen delen van het skelet toeneemt. Vanaf het zesde uur, en de twintigste dag inclusief de contralaterale tibia wordt waargenomen in meer dan tweevoudige toename van de concentraties en het aantal cellen kolonies fibroblasten. Het mechanisme van dit verschijnsel hangt waarschijnlijk samen met het feit dat een grote beenmerg verwonding resulteert in de vorming van een groot aantal bloedstolsels, terwijl tegelijkertijd een aanzienlijk aantal bloedplaatjes en de introductie in de bloedplaatjes afgeleide groeifactor (RBSBAOSAHDDC), waarvan bekend is dat proliferatie van cellen kolonies veroorzaken vernietigen fibroblasten in het lichaam buiten de proliferatieve pool. In experimenten met konijnen bevordert lokale toediening MSC chirurgisch herstel van beschadigd kraakbeen van de knie, die kan worden geassocieerd met de vorming van chondrocyten afgeleid van MSCs geïntroduceerd. Herstelregeneratie van botdefecten in laboratoriumratten wordt echter sterk verbeterd door het gebruik van mesenchymale stamcellen ingekapseld in een keramisch raamwerk. Daarom kunnen we aannemen dat als je niet RBOK dan enige andere factor, verkregen uit de beschadigde stromale cellen, een verre stimulerend effect op de proliferatie van mesenchymale progenitorcellen in intacte gebieden van het beenmerg en stimuleert de migratie naar de plaats van het defect beenmergweefsel. Op zijn beurt, dit in tegenstelling tot de literatuur gegevens van voorgaande jaren, wat aangeeft dat stromale cellen zijn verantwoordelijk voor de micro-omgeving, in tegenstelling tot hematopoietische cellen zijn niet in staat om te migreren en zijn afkomstig van lokale bronnen.

Niettemin zijn de resultaten van het onderzoek Gerasimov Yu et al (2001) wijst erop dat de toepassing van mechanische trauma veroorzaakt niet alleen een forse herstructurering van stromale weefsel in kyuretirovannoy botten, maar ook belangrijke veranderingen in het stroma afgelegen botten intact, dat wil zeggen, er is een systemische reactie stromaal weefsel voor lokaal trauma. En wanneer toegepast polytrauma - meerdere curettage - deze reactie geamplificeerd en waargenomen niet alleen in de geopereerde bot en afgelegen delen van het skelet, maar ook in de lymfoïde organen, met name de milt. Het mechanisme van een dergelijke systemische respons van stromaalweefsel en milt van het beenmerg op lokaal trauma en polytrauma is onbekend. Aangenomen wordt dat deze werkwijze gepaard gaat met de werking van de humorale factor bezit mesenchymale stroma medullair beenmerg holte. Mogelijkheid om beenmerg stromale cellen en milt organonespetsificheskogo humorale factor die verantwoordelijk is voor celproliferatie, kolonievormende fibroblasten geven gegevens over hun koloniestimulerende activiteit in monolaag kweken van beenmerg.

In dit verband zij erop gewezen dat wanneer systemisch toegediend multipotente mesenchymale precursorcellen repopulatie daarvan afgeleide niet alleen het beenmerg, maar ook ander weefsel, dat wordt toegepast, in het bijzonder voor gentherapie. Het is gebleken dat na intraveneuze toediening van grote hoeveelheden MSC's met het genoom van wildtype muizen met mutant collageen gen I donorcellen vervangen tot 30% van de cellen in bot- en kraakbeenweefsel van de ontvanger, en de getransfecteerde mesenchymale stamcellen muizen cellen die IL-3 humaan, 9 maanden effectief ondersteunen hematopoiese bij de gelijktijdige toediening met humane hematopoietische stamcellen in immunodeficiënte muizen.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]

Genetische modificatie van mesenchymale stamcellen

Aanvullende experimentele succes van de genetische modificatie opgemerkt MSC transfectie Factor IX-gen in menselijke MSC's, gevolgd door overdracht van celtransfectanten immunodeficiënte muizen, wat leidt tot het verschijnen van bloed antihemofiliefactor B over 8 weken na transplantatie. In dit experiment werd posttranslationele modificatie van factor IX met y-glutamylcarboxylase uitgevoerd in getransfecteerde cellen. Transductie van MSC's met een retrovirale vector die codeert voor humane factor IX, minder succesvol geweest - latere invoering van deze cellen met hemofilie hond in een therapeutische hoeveelheid van factor IX, die normale intensiteit coagulatie hemostase ondersteunt alleen 12 dagen.

De transplantatie van mesenchymale stamcellen in het hersenparenchym van dieren heeft aangetoond dat onrijpe cellen van de donor worden getransformeerd, zowel in de populatie van neuronen als glia. Engraftment neuronale derivaten gezonde donor mesenchymweefsel theorie maakt de correctie van genetische afwijkingen van de hersenen metabolisme bij patiënten met de ziekte van Gaucher en andere aandoeningen van het lipidenmetabolisme, koolhydraat of gangliosiden.

Voortgezette experimentele zoekvoorwaarden transdifferentiatie van stamcellen in het beenmerg stromale precursorcellen in het zenuwstelsel en leverweefsel. De aandacht van onderzoekers is gericht op combinaties van differentiatie-inductoren en speciale conditioneringsmedia. In het bijzonder voor het isoleren van de primaire kweek met 10% foetaal kalfsserum, beenmerg stromale cellen gewassen en opnieuw gesuspendeerd in DMEM / F12 cultuurmedium (1/1) worden uitgezet met een dichtheid van 200.000 / cm2. Na 24 uur worden niet-hechtende cellen verwijderd en worden fibroblastachtige cellen gehecht aan het plastic gedurende één week gekweekt. Voor de differentiatie van beenmerg stromale cellen neuroblasts gebruikt geconditioneerd medium verkregen door het kweken driedaagse kweek van primaire muis embryonale fibroblasten, alsook tussen DMEM / F12 (1/1) met 2% foetaal kalverserum en verrijkt met 20 ng / ml of 10-6 M LiF retinoïnezuur (neuroinductoren, die worden gebruikt voor neurale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen en mensen). De differentiatie van beenmerg stromale cellen tot stamcellen tot hepatocyten geïnduceerd geconditioneerde omgeving gecreëerd als resultaat van drie dagen kweken van een primaire kweek van embryonale muizenlever cellen in DMEM / F12 (1/1) medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum.

Hier moet nogmaals worden opgemerkt dat de kolonievormende cellen van het beenmergstroma heteromorf zijn en in twee typen kunnen worden verdeeld. Het eerste type omvat fibroblastachtige cellen die filopodia-cellen vormen met grote kernen en een of twee nucleoli. Het tweede type wordt weergegeven door kleine cellen met een spilvormige vorm. Bij het kweken van cellen van beide typen in het geconditioneerde medium verkregen op de toevoerlaag van primaire embryonale muizen fibroblasten, verschijnen cellen die vergelijkbaar zijn met neuroblasten op de derde en vierde dag in kweek. In dit stadium hebben ze vaak een spilvormige vorm met een of twee lange processen die eindigen op filopodia. Piramidale of stellaatcellen met korte dendrieten komen minder vaak voor. Dendrieten een neuroblasts hebben typisch expansie (groei nier) en vertakking in het distale gedeelte, het andere - met een duidelijke groeikegels filopodia, waardoorheen dendriet groei optreedt. Vergelijkbare morfologische tekenen (nieren en groeibellen met filopodia), inherent aan neuroblasten, differentiëren tot neuronen, worden in detail beschreven in werken over neurogenese. Op basis hiervan concluderen sommige auteurs dat de cellen die ze in cultuur detecteren neuroblasten zijn. Vooral Schegelskaya E. Et al (2002), na een primaire kweek van stromale cellen gekweekt gedurende twee weken in een vervangbare bij elke Z-en-4 dagen geconditioneerd medium gevonden dat een deel van de prolifererende cellen, met behoud van de gedifferentieerde toestand. Uiterlijk leken dergelijke cellen op fibroblasten en werden ze geïdentificeerd in kweek samen met differentiërende neuroblasten. De meeste cellen (ongeveer 80%) waren in verschillende stadia van differentiatie in cellen van het zenuwweefsel, voornamelijk in neuronen. De dendritische processen van deze cellen kwamen nauw met elkaar in contact, zodat de cellen zich geleidelijk vormden op de substraatsecties van het zenuwnetwerk in de vorm van lange multicellulaire strengen. Dendritische processen van neuroblasten groeiden veel langer, sommige 8-10 keer hoger dan de lengte van het lichaam van het neuron zelf. Geleidelijk aan nam het aandeel van piramidale en stellaatcellen toe. Dendrieten van stellatum cellen vertakt. Volgens de auteurs komt de latere differentiatie van piramidale en stellaatcellen in vergelijking met spilvormige cellen overeen met de sequentie van stadia van normale neurogenese bij dieren. Als gevolg hiervan concluderen de auteurs dat stamcellen van het beenmergstroma geïnduceerde neurogenese zijn, waarbij in vitro uit neuroblasten alle drie hoofdtypen van neuronen worden gevormd. Voorlopers van zenuwcellen werden ook gedetecteerd gedurende het kweken van beenmergstromacellen gedurende 3-4 dagen in medium met 2% foetaal serum en 20 ng / ml LIF. Maar in dit geval waren de stamcellen zeer langzaam verdeeld, de differentiatie van de neuroblasten gebeurde slechts in 30% van de gevallen en ze vormden geen neurale netwerken. Gebruik als een zenuw celdifferentiatie induceren retinoïnezuur, de auteurs verkregen in kweek tot 25-30% van de zenuwcellen met een overwicht van gliacellen - astrocyten en oligodendrocyten. Neuronen waren goed voor slechts een derde van alle zenuwcellen, hoewel ze door alle drie soorten werden vertegenwoordigd: fusiforme, piramidale en stellaatcellen. Op de 6e dag van het kweken stromale cellen in retinolzuur medium zenuwcellen werden meer gedifferentieerd, terwijl de individuele axonen van piramidale neuronen gevonden die in de normale neuroontogenesis verschijnen later de vorming van de dendritische processen. Volgens de auteurs, ondanks de lage opbrengst aan zenuwcellen, de werkwijze voor het induceren retinoïnezuur heeft voordelen: astrocyten en oligodendrocyten en myeliniserende werking invoerfuncties tijdens de groei van axons en dendrieten en noodzakelijk voor de normale vorming van zenuwweefsel zijn. Daarom is het beter om de beschadigde sites in vivo te repareren met een suspensie van neuronen verrijkt met gliacellen.

In de tweede reeks experimenten probeerden de auteurs differentiatie van beenmerg-stromale cellen in levercellen te induceren. Na drie dagen kweek van beenmerg stromale stamcellen in het geconditioneerde medium verkregen door het incuberen van muis embryonale hepatocyten hebben grote bolvormige cellen gevonden, vaak twee-nucleaire, cytoplasmatische insluitsels met verschillende maten. Deze cellen waren in verschillende stadia van differentiatie en verschilden in grootte, aantal kernen en insluitsels in het cytoplasma. In de meeste van deze cellen werd gedetecteerd glycogeen, waardoor we ze hebben geïdentificeerd als hepatocyte voorlopercellen. Aangezien de kweek werden geen cellen vergelijkbaar met neuroblasts gedetecteerd, gevolgd door een conclusie die in het geconditioneerde medium verkregen door het kweken van embryonale hepatocyten, zijn er geen elementen van differentiatie van zenuwcellen en omgekeerd, er factoren die differentiatie van beenmerg stromale cellen induceren in progenitorcellen hepatocyten . De auteurs suggereren de aanwezigheid van pluripotente stamcellen uit beenmerg stroma mocht differentiëren in vitro in cellen lever- of neuraal weefsel afhankelijk van de specifieke geconditioneerde medium en spoelen.

In sommige werken wordt de differentiatie van beenmergstromacellen tot cardiomyocyten, kraakbeen, bot en neurale weefselcellen inderdaad correct weergegeven. Er is informatie dat er in de cellen van het beenmerg populaties van stamcellen zijn die zich kunnen differentiëren in hepatocyten. In het licht van deze gegevens kunnen de resultaten van de bovenstaande experimenten op muizen nog steeds worden beschouwd als een andere bevestiging van de aanwezigheid in het beenmerg van pluripotente mesenchymale stamcellen die het vermogen hebben om te differentiëren tot cellen van verschillende weefsels van een volwassen organisme.

Transplantatie van mesenchymale stamcellen

In klinische transplantatie van menselijke mesenchymale stamcellen kunnen worden gebruikt voor expansie van hematopoietische stamcellen en hun nakomelingen vroege prekommitirovannyh. Vooral de invoering van autologe hematopoietische stamcellen en MSCs kankerpatiënten na chemotherapie met sterk versnelt het herstel van neutrofielen en bloedplaatjes in perifeer bloed. Autologe en allogene transplantatie van mesenchymale stamcellen voor het multipel myeloom, aplastische anemie, trombocytopenie spontane behandeling - ziekten geassocieerd met primaire hematopoietische afwijking stromaweefsel. De efficiëntie van celtherapie bij hematologische aandoeningen vaak boven, terwijl de invoering van stromale en hemopoietische stamcellen, die een vermindering van de postoperatieve herstelperiode, bloed, vermindering van het aantal sterfgevallen geopenbaard door niet-selectieve vernietiging regionale en circulerende kankercellen, waarbij de matrijs en de eigen progenitor hematopoïetische cellen van een patiënt. MSCs veelbelovende toepassingen en andere multipotente mesenchymale voorlopercellen in de klinische praktijk vanwege hun relatieve gemak van het verkrijgen van aspiraten van beenmerg, groei in kweek en transfectie van het therapeutische gen. Aldus compenseren lokale weefseldefecten kan een lokale implantatie van multipotente mesenchymale precursorcellen en systemische disfunctie van weefsels van mesenchymale oorsprong te gebruiken is zij in het algemene verkeer worden uitgesloten.

Voorzichtiger hun argumenten de auteurs van werken waarin het perspectief van MSC voor lokale, systemische transplantatie en gentherapie worden geanalyseerd vanuit het oogpunt van de biologie stromale cellen. Postnataal beenmerg wordt traditioneel beschouwd als een orgaan dat bestaat uit twee hoofdsystemen afzonderlijke cellijnen - eigenlijk hematopoïetische weefsels en de bijbehorende ondersteunende stroma. Daarom beenmerg mesenchymale stamcellen aanvankelijk slechts beschouwd als een bron van stromale basis voor de productie van regulerende factoren hematopoïetische micromilieu. Daarna ging de aandacht van de onderzoekers over op het bestuderen van de rol van MSC als een stambron van skeletweefsels. De meest recente gegevens wijzen op een onverwacht potentieel van differentiatie van stromale cellen in het beenmerg met de vorming van een neuraal of spierweefsel. Met andere woorden, mesenchymale stamcellen vertonen transgermale plasticiteit - het vermogen om te differentiëren tot cellulaire typen die fenotypisch niet gerelateerd zijn aan de cellen van het oorspronkelijke weefsel. Echter, sommige aspecten van de biologie van stromale beenmergcellen onduidelijk blijven en onopgeloste in het algemeen biologische plan, en in sommige detail, met inbegrip van identificatie, natuur, de oorsprong en ontwikkeling en functie in vivo beenmerg stromale cellen, evenals de toegestane potentiële differentiatie ex vivo en de mogelijkheid therapeutisch gebruik in vivo. De gegevens over de potentiële mogelijkheden van MSC, evenals de resultaten van studies van andere regeneratieve mogelijkheden van stamcellen, in schril contrast met de gevestigde dogma in de biologie.

Wanneer gekweekt onder omstandigheden met lage dichtheid, vormen stromale cellen van beenmergstammen verschillende kolonies, die elk een derivaat zijn van een enkele precursorcel. Het percentage stromale voorlopercellen in genucleëerde beenmergcellen, bepaald door het vermogen koloniën te vormen, hangt in belangrijke mate af van zowel de kweekomstandigheden als de soorten die behoren tot het MSC. Bijvoorbeeld, in het knaagdier om het maximale aantal stromale stamcellen te verkrijgen bij aanwezigheid van bestraalde feeder kweek van beenmergcellen en serum absoluut noodzakelijk, terwijl de kolonievormende efficiëntie van menselijke mesenchymale stamcellen onafhankelijk van de toevoerinrichting of uit het kweekmedium. Het aantal bekende mitogene factoren die de proliferatie van stromale voorlopercellen stimuleren, is beperkt. Deze omvatten PDGF, EGF, FGF, TGF-b en ook IGF1. Onder optimale kweekomstandigheden overleven de polyklonale lijnen van MSC in vitro meer dan 50 celdelingen, wat het mogelijk maakt om miljarden beenmergstromacellen te verkrijgen uit 1 ml van zijn aspiraat.

De populatie van beenmerg stromale cellen is heterogeen, dat manifesteert zich als variabiliteit in de grootte van de kolonies ander niveau van hun vorming en diverse celmorfologie, waar diverse fibroblast-achtige spil grote platte cellen omvat. Met de ontwikkeling van dergelijke gewassen na 20 dagen wordt ook fenotypische heterogeniteit opgemerkt. Sommige kolonies worden sterk tot expressie gebracht door alkalische fosfatase, andere drukken het helemaal niet uit, en type 3-kolonies zijn fosfatase-positief in het centrale gebied en fosfatase-negatief aan de periferie. Afzonderlijke kolonies vormen knobbeltjes van botweefsel (het begin van matrixmineralisatie is gemarkeerd wanneer gekleurd met alizarinerood of op calcium door Van-Koss). In andere koloniën vindt vetophoping plaats, geïdentificeerd door G-kleuring met olierood. Minder vaak vormen de kolonies van de mesenchymale stamcellen kraakbeen dat gekleurd is met alcyanblauw).

Na ectopische transplantatie bij proefdieren polyklonale MGK lijnen vormen ectopische bot stroma met setchatoobraznoy geassocieerd met myelopoiese en adipocyten, ook, maar zelden met kraakbeenweefsel. In monoklonale lijnen transplantatie van beenmerg stromale cellen in sommige gevallen chimerisme, waarbij de novo gevormde botweefsel bestaat botcellen, adipocyten omvat stroma en donor oorsprong, terwijl cellijnen van hematopoëtische en bloedvaten zijn afgeleid van de ontvanger.

De resultaten van deze studies bevestigen de stam-aard van de stromale beenmergvoorloper, waaruit de klonale lijn werd verkregen. Ze laten tegelijkertijd ook zien dat niet alle klonen in kweekcellen echt multipotente stamcellen zijn. Sommige onderzoekers geloven, en we delen hun mening, dat de meest accurate informatie over de werkelijke mogelijkheden van differentiatie van individuele klonen alleen in vivo kan worden verkregen na transplantatie, in plaats van door het bepalen van het fenotype van de derivaten in vitro. Expressie in osteo- kweek fenotypische merkers hondro- of adipogenese (bepaald met mRNA of via histochemische technieken), en ook de productie van gemineraliseerde matrix geeft niet de mate van pluripotentie enkele kloon in vivo. Daarom is de identificatie van stamcellen in de stromale celgroep alleen posteriori mogelijk, onder de juiste omstandigheden van een biologische transplantatietest. Vooral chondrogenese zeer zelden waargenomen bij transplantatie open systemen, terwijl de vorming van kraakbeen is niet ongewoon in gesloten systemen, zoals diffusiekamers of mikromassnyh kweken van stromale cellen in vitro, waarbij bereikte plaatselijk lage zuurstofspanning, bij aan de vorming van kraakbeen. Dientengevolge beïnvloedt zelfs de techniek van transplantatie, evenals niet-specifieke in vitro kweekomstandigheden, het bereik van MSC-differentiatie aanzienlijk.

Experimentele transplantatie met inachtneming van gegeven experimentele omstandigheden is de gouden standaard voor het bepalen van het potentieel voor differentiatie van stromale cellen van het beenmerg en het sleutelelement van hun juiste identificatie. Historisch gezien zijn beenmergtransplantatieonderzoeken naar het beenmerg geassocieerd met een algemeen beenmergtransplantatieprobleem. Er werd vastgesteld dat de hemopoietische micro-omgeving wordt gecreëerd door transplantatie van stromale cellen van het beenmerg en zorgt voor de ectopische ontwikkeling van hemopoietisch weefsel in de transplantatiezone. De oorsprong van de micro-omgeving van de donor en hematopoietisch weefsel - van de gastheer stelt ons in staat om het ectopische bot te behandelen als een echte "omgekeerde" beenmergtransplantatie. Lokale transplantatie van stromale cellen van beenmerg bevordert een effectieve correctie van botdefecten, meer uitgesproken dan bij spontane herstellende regeneratie. In verschillende preklinische studies in diermodellen overtuigend bewezen de mogelijkheid van transplantatie van beenmerg stromale cellen in orthopedie, hoewel deze methoden te optimaliseren, zelfs in de meest eenvoudige gevallen, vereisen de meest zorgvuldige werk en analyse. In het bijzonder zijn de optimale omstandigheden voor de ex vivo expansie van osteogene stromale cellen nog niet vastgesteld, blijven de structuur en samenstelling van de ideale drager ongebruikt, evenals het aantal cellen dat nodig is voor bulkbotregeneratie.

Bij toepassing van ex vivo gekweekt beenmerg stromale cellen voor weefselregeneratie van mesenchymale oorsprong ongebruikelijke rekbaarheid MSC opent het mogelijke gebruik voor het regenereren van neurale cellen, of de levering van genproducten in het CZS. In principe vereenvoudigt dit de cellulaire therapie bij het verslaan van het zenuwstelsel, omdat het niet nodig is om autologe neurale stamcellen van mensen te verkrijgen. Er wordt gerapporteerd over de mogelijkheden van het gebruik van beenmergcellen voor het genereren van cardiomyocyten en myogene precursorcellen als een echte stromale en extrinsieke oorsprong.

Er worden experimenten uitgevoerd op systemische transplantatie van stromale cellen van het beenmerg voor de behandeling van veel voorkomende skeletaandoeningen. Ongetwijfeld beenmerg stromale cellen zijn een populatie verantwoordelijk voor erfelijke afwijkingen bij ziekten van het skelet, die goed wordt geïllustreerd door de vector overdracht met de genetische informatie van de cellen, wat leidt tot de vorming van pathologische botweefsel bij proefdieren. Het vermogen van stromale cellen om te implanteren, te groeien, te vermenigvuldigen en te differentiëren in de botten van het skelet na introductie in de algemene bloedstroom is echter nog niet bewezen.

Dit is deels te wijten aan het feit dat de standaard procedure van beenmerg stroma niet worden getransplanteerd met hematopoietische weefsel, dus strikte criteria voor het beoordelen van een succesvolle implantatie van het systemisch toedienen van stromale cellen moeten nog worden ontwikkeld. Men moet niet vergeten dat de aanwezigheid van merkergenen in weefselextracten of de isolatie in de kweek van cellen van donoroorsprong niet duidt op de implantatie van cellen, maar alleen op hun overleving. Ook intra-arteriële injectie van beenmerg stromale cellen in de muis ledematen kan leiden tot vrijwel nul resultaat engraftment, ondanks het feit dat van donor afgeleide cellen in grote aantallen in het beenmerg microvasculaire netwerk. Ongelukkigerwijze worden dergelijke cellen gewoonlijk alleen als "geënt" beschreven op basis van de resultaten van de bepaling van merker-donorgenen onder ex vivo kweekomstandigheden. Bovendien is het noodzakelijk overtuigend bewijs te leveren van langetermijnintegratie in de weefsels van gedifferentieerde en functioneel actieve cellen van donoroorsprong. In veel gepubliceerde werken, waar het wordt gerapporteerd over de engraftment van stromale cellen van het beenmerg in het skelet, is het ontbreken van duidelijke gegevens van deze soort opvallend. Niettemin dient te worden opgemerkt dat bij enkele juiste experimenten op dieren echter een beperkte maar werkelijke enting van stromale progenitorcellen na hun systemische toediening is vastgesteld.

Deze gegevens komen overeen met de resultaten van de studie naar de mogelijkheid om myogene beenmergvoorlopercellen via het vasculaire systeem aan de spieren af te leveren. Men mag echter niet vergeten dat zowel skelet- als spierweefsels worden gevormd tijdens de ontwikkeling en groei op basis van extravasculaire celbewegingen die migratieprocessen gebruiken die geen circulatie in het bloed met zich meebrengen. Als er echt een onafhankelijke circulatieroute bestaat voor de levering van precursorcellen aan weefsels in vaste fase, is het dan mogelijk om het bestaan van fysiologisch circulerende mesenchymale voorlopercellen mogelijk te maken? Wat is de oorsprong van deze cellen in zowel het zich ontwikkelende als het postnatale organisme en hoe dringen ze de vaatwand binnen? De oplossing van deze problemen is absoluut noodzakelijk en vereist de grondigste preklinische analyse. Zelfs nadat de antwoorden op deze vragen zijn gevonden, blijven de problematische kinetische aspecten in verband met skeletgroei en remodeling van bindweefsel onopgelost. Tegelijkertijd lijkt de behandeling van osteogenese aandoeningen door het vervangen van de gehele populatie van gemuteerde skelet-progenitorcellen door gezonde stromale cellen een echt klinisch perspectief te zijn. In dit geval kunnen lokale zones van breuk of vervorming als gevolg van pathologische osteogenese, evenals destructieve veranderingen in botweefsel, worden gecorrigeerd door gekweekte in vitro stromale stamcellen. Daarom moet de richting van toekomstig onderzoek gericht zijn op de problemen van transformatie of genetische correctie van autologe gemuteerde osteogene progenitorcellen ex vivo.

Genetische manipulatie van de cellen, tijdelijk of permanent, werd de basis van cel- en moleculaire biologie, de bron van vele wetenschappelijke inzichten over de rol van individuele eiwitten in de cellulaire stofwisseling in vitro stoffen en in vivo. Het gebruik van moleculaire technieken erfelijke ziekten en ziekten bij de mens te corrigeren is veelbelovend om praktische geneeskunde, aangezien de eigenschappen van stromale beenmergstamcellen maken unieke circuits transplantatie voor het corrigeren van genetische ziekten van het skelet te ontwikkelen. In dit geval kan de mesenchymale stamcellen vrij gemakkelijk worden verkregen uit de toekomst ontvanger, ze vatbaar zijn voor genetische manipulatie en zijn in staat om te broeden in grote aantallen in een korte periode van tijd. Het gebruik van mesenchymale stamcellen vermijdt de beperkingen en risico's die gepaard gaan met de levering van genetisch informatiemateriaal rechtstreeks aan de patiënt door middel van vectomale vectorstructuren. Deze strategie is van toepassing op de pi embryonale stamcellen, maar postnataal autoloog beenmerg stromale cellen - een voorkeursmateriaal omdat hun toediening uitsluit eventuele immunologische complicaties na transplantatie. Om korte termijn effect te bereiken, bijvoorbeeld om botregeneratie te versnellen, de optimale werkwijze is de genetische modificatie van mesenchymale stamcellen met behulp elektroporatsrsh, chemische fusie, lipofectie, plasmiden en adenovirale constructen. Met name virale transfectie in stromale beenmergcellen BMP-2 was effectief in het versnellen van de regeneratie van bot in experimentele polytrauma. Creatie van adenovirale vectorstructuren heeft de voorkeur vanwege de afwezigheid van toxiciteit. De genetische modificatie van beenmergstromacellen wordt in dit geval echter gekenmerkt door een extreem lage stabiliteit. Voorts getransformeerde normale beenmerg stromale cellen vereisen het gebruik van vector dragers van genetische informatie 10 keer meer infectief dan andere celsoorten, waarbij het percentage van de dood van de getransfecteerde cellen aanzienlijk verhoogt.

Voor het behandelen recessieve aandoeningen veroorzaakt door lage of geen biologische activiteit van bepaalde genen die nodig zijn langdurige of permanente modificatie van mesenchymale stamcellen, die het gebruik van adeno- geassocieerde virussen, retrovirussen, lentivirussen en adeno-retrovirale chimeer vereist. Transportplaatsen van deze virussen zijn in staat grote DNA-transfecten te dragen (tot 8 kb). In de wetenschappelijke literatuur is reeds informatie verschenen over de biologische activiteit van exogene beenmerg stromale cellen getransfecteerd met retrovirale constructen die coderen voor de synthese van regulerende moleculen en markers - IL-3, CD2, factor VIII, en de enzymen betrokken bij de synthese van L-DOPA. Maar in deze werken wijzen de auteurs op een aantal beperkingen die moeten worden overwonnen voordat de praktische toepassing van deze technologie begint. Het eerste probleem is om het MCK ex vivo modificatieproces te optimaliseren. Het is bekend dat een langdurige (3-4 weken) proliferatie van stromale cellen van beenmerg in vitro hun transfectie vermindert. Tegelijkertijd zijn verschillende cycli van transfusie vereist om een hoog niveau van genetische modificatie van MSC's te bereiken. Het tweede probleem houdt verband met de duur van de expressie van het therapeutische gen, dat nog geen vier maanden overschrijdt. Een natuurlijke afname in effectieve genexpressie is te wijten aan de inactivatie van promoters en de dood van gemodificeerde cellen. In algemene vooruitzichten overdracht van genetische informatie met behulp van mesenchymale stamcellen resultaten van voorbereidende studies wijzen op de noodzaak van verdere optimalisatie van transfectie methoden ex vivo, het selecteren van een geschikte promoter reguleren van de biologische activiteit in de juiste richting, en verbetering van het vermogen van de gemodificeerde stromale beenmergcellen om zichzelf te vernieuwen in vivo na transplantatie. Opgemerkt wordt dat het gebruik van retrovirale constructen voor de modificatie van beenmerg stromale cellen in de gewenste richting hun verplichte enting niet altijd vereist. Getransfecteerde mesenchymale stamcel kan een corrigerende functie op de achtergrond van stabiele en verblijf voeren zonder actieve fysieke inbouw en functioneren in het bindweefsel. In dit geval moeten ze worden beschouwd als een biologische minipomp, die in vivo factor produceert, waarvan het tekort de manifestatie van genetische pathologie bepaalt.

Gebruik van getransformeerde beenmerg stromale cellen voor behandeling van dominante erfelijke ziekte die wordt gekenmerkt door de expressie van het gen of abnormale pathologische biologische activiteit, is veel problematischer omdat in dit geval is het noodzakelijk om de overdracht of verkoop van de genetische informatie vervormd blokkeren. Een van de methoden van genetische manipulatie is de homologe recombinatie van embryonale stamcellen om transgene dieren te creëren. Echter, het extreem lage niveau van homologe recombinant, in combinatie met de problemen van identificatie, scheiding en uitbreiding van dergelijke recombinanten is het onwaarschijnlijk dat wijdverbreide gebruik van deze techniek te bevorderen in de nabije toekomst, zelfs als de ontwikkeling van nieuwe technologische methoden. De tweede benadering voor gentherapie is gebaseerd op de dominante pathologie automatische correctie van beschadigde DNA genetische mutaties kunnen worden gecorrigeerd door het inbrengen van het exogene DNA met de gewenste sequentie (korte DNA-oligonucleotiden, of chimere RNA / DNA-oligonucleotiden) die binden aan homologen in het beschadigde genoom. De derde uitvoeringsvorm verschaft pathologische informatieverzending slot dat wordt bereikt door het gebruik van specifiek ontworpen oligonucleotiden die binden aan een bepaald gen te ternaire helixstructuur, die de mogelijkheid van transcriptie uitsluit vormen.

Hoewel de correctie van genetische ziekten in het genoom niveau optimale en geprefereerde therapeutische werkwijze mRNA eveneens veelbelovend vector (misschien nog toegankelijker) voor het blokkeren van een dominant negatief gen. Teneinde translatie en / of het verhogen mRNA afbraak remmen zijn lang gebruikt eiwitmoleculen Antisense oligonucleotide sequenties of volledige blokkering binding van mRNA biosynthetische apparaat van de cel. Bovendien induceert dubbelstrengig RNA snelle degradatie van mRNA, waarvan het mechanisme onduidelijk blijft. Het is echter onwaarschijnlijk dat de loutere verwijdering van het mRNA dat van een mutant allel met korte of enkele mutaties mRNA-expressie van het normale allel zal bevorderen. Een alternatief is het gebruik ribozinov hammerhead en haarspeld, het vermogen te binden aan zeer specifieke gebieden van mRNA met daarop volgende inductie van dissociatie- en inactivering tijdens de vertaling. Momenteel wordt de mogelijkheid bestudeerd om deze methode te gebruiken bij de behandeling van pathologische osteogenese. Ongeacht wat precies het doel - genomische of cytoplasmatische elementen succes van nieuwe gentherapie technologie zal worden bepaald door de efficiëntie van opnemen van reagentia in beenmerg stromale cellen ex vivo, de optimale keuze van een specifieke vector en stabiele vermogen van mesenchymale stamcellen de gewenste factoren in vivo expressie.

Zo creëert de ontdekking van mesenchymale stamcellen met hun onverwachte eigenschappen een nieuw conceptueel schema voor de ontwikkeling van cellijnen. Maar om de biologische rol van stromale stamcellen te begrijpen, hun aard, de mogelijkheid om transdifferentiatie of dedifferentiatie, hun fysiologische belang in het proces van de embryonale ontwikkeling, postnatale groei, rijping en veroudering, alsmede in ziekten bij de mens verder moeten worden interdisciplinair onderzoek.