Embryonale stamcellen

De ontdekking van embryonale stamcellen kwam niet toevallig tot stand, maar ontstond op het voorbereide terrein van wetenschappelijk onderzoek in de ontwikkelingsbiologie. De term "stamcel" werd in 1908 in de geneeskunde geïntroduceerd tijdens het congres van de hematologische vereniging in Berlijn door Alexander Maximov met betrekking tot hematopoëtische cellen. Lang vóór de isolatie en productie van stabiele lijnen van pluripotente embryonale stamcellen, werden terato-(embryocarcinoom) stamcellen gebruikt in studies naar vroege ontwikkelingsprocessen, met behulp waarvan onbekende mechanismen van embryogenese werden bestudeerd, waaronder de expressievolgorde van vroege genen en eiwitproducten van hun activiteit.

Maar gaat de totipotentie van het menselijk genoom onherroepelijk verloren in het evolutieproces? Nee, en embryogenese bewijst dit. Zo ja, wanneer zal dan in principe het tweede pad van evolutionaire ontwikkeling worden gerealiseerd? Waarschijnlijk wanneer de mens de ruimte betreedt, waar de omgevingsomstandigheden gedurende een voldoende lange tijd relatief constant zullen zijn. Het verlies van botweefsel (demineralisatie van botten in een toestand van gewichtloosheid), dat zeer langzaam onderhevig is aan hermodellering en regeneratie, kan worden beschouwd als de eerste stap in het aanpassingsproces van de mens, als soort, aan het bestaan in de ruimte. De prijs voor het tweede pad van evolutionaire ontwikkeling zal echter anders zijn - de prijs voor de terugkeer van totipotentie en absolute plasticiteit van alle cellen zal steriliteit zijn. Dus, in deze wereld van "evolutionaire kameleons", zullen we ons moeten voortplanten zonder meiose, door middel van knopvorming. Maar we zullen lang leven. Telomerase-onsterfelijkheid is de onsterfelijkheid van een amoebe. In een meercellig organisme zijn stamcellen het substraat voor kwantitatieve en kwalitatieve levensduur.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Bronnen van embryonale stamcellen

De bronnen van embryonale stamcellen voor laboratoriumonderzoek zijn tegenwoordig muizenteratocarcinoomlijnen (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) en humaan teratocarcinoom (NTERA-2, TERA-2, H-9-kloon), evenals Trauneon ESC-lijnen. De beschikbaarheid van een gedetailleerd celpaspoort met informatie over het immuunfenotype, de resultaten van chromosoomanalyse, mRNA-expressieprofielen, blootgestelde receptoren en intracellulaire signaaleiwitten compenseert echter niet de significante tekortkomingen van teratocarcinoom ESC-lijnen: het snelle verlies van totipotentie en de onmogelijkheid om ze te gebruiken in klinische studies, terwijl gemengde differentiatie in kweek het zeer moeilijk maakt om een zuivere gespecialiseerde lijn te isoleren uit een heterogene celpopulatie. Daarom zijn de bronnen van ESC-lijnen die voor klinische doeleinden worden gecreëerd doorgaans de binnenste celmassa van de blastocyst, individuele blastomeren van embryo's in het 8-cellige stadium, morulacellen van latere stadia en primordiale kiemcellen.

Opgemerkt dient te worden dat teratocarcinoomcellen, hoewel ze de eigenschap pluripotentie hebben, worden gekenmerkt door een significant lager pluripotent potentieel in vergelijking met ES-cellen. Hun integratie met embryonale cellen leidt zelden tot de vorming van chimeren, die bovendien nooit gameten vormen met het genotype van teratocarcinoomcellen. Men vermoedt dat dit te wijten is aan het frequent voorkomen van chromosomale afwijkingen tijdens de kweek van teratocarcinoomcellen: verlies van het Y-chromosoom, diverse trisomieën, deleties of translocaties.

Er zijn herhaaldelijk pogingen gedaan om een menselijke ESC-lijn te isoleren, maar deze taak is nog niet opgelost, omdat normale menselijke blastocysten moeilijk te bereiken zijn. Bovendien is de frequentie van chromosomale afwijkingen bij mensen hoger dan bij dierlijke embryogenese. De overgrote meerderheid van de vroege menselijke embryo's die na in-vitrofertilisatie worden verkregen, vertoont chaotisch chromosomaal mozaïcisme en heeft vaak numerieke en structurele afwijkingen. Zelfs later, in het blastocyststadium, bestaat slechts 20-25% van de menselijke embryo's uit cellen met een normaal karyotype. Het was vrijwel onmogelijk om dergelijke embryo's te gebruiken om ESC's te creëren, omdat zygoten meestal werden gekweekt tot het twee- of vierblastomeerstadium en vervolgens in de baarmoeder werden getransplanteerd. Pas relatief recent is er een betrouwbare techniek ontwikkeld om bevruchte menselijke eicellen tot het blastocyststadium te kweken. De introductie van deze techniek in de praktijk van in-vitrofertilisatie heeft niet alleen de frequentie van succesvolle implantatieresultaten verhoogd, maar ook normale blastocysten een toegankelijker object gemaakt.

Een andere bron van pluripotente stamcellen zijn de primordiale kiemcellen. Deze cellen, in tegenstelling tot de meer geavanceerde voorloperpopulaties van het kiemepitheel, hebben geen bèta-integrine op hun oppervlak, maar vertonen een hoge activiteit van alkalische fosfatase. Opgemerkt moet worden dat populaties stamcellen die gevormd zijn uit primordiale kiemcellen al sinds de jaren 80 experimenteel worden bestudeerd. In die tijd werd een techniek ontwikkeld om primordiale kiemcellen te isoleren uit het rudiment van de gonade van het muizenembryo. De eerste mislukte resultaten van het in vitro kweken van primordiale kiemcellen suggereerden de futiliteit van deze pogingen, aangezien de cellen, hoewel ze overleefden, niet prolifereerden en binnen de eerste dag stierven. Later werd vastgesteld dat primordiale kiemcellen van muizen zich in vitro alleen voortplanten in aanwezigheid van oplosbare en membraangebonden specifieke polypeptidegroeifactoren in het kweekmedium. De resultaten van talrijke studies hebben aangetoond dat voor de overleving en proliferatie van primaire kiemcellen de aanwezigheid van niet alleen LIF, maar ook membraangebonden en oplosbare Steel-factoren (SIF) in het kweekmedium noodzakelijk is. Deze peptiden worden geproduceerd door somatische cellen van embryo's die homozygoot zijn voor de Steel-mutatie, en één ervan is een ligand van het cKit-proto-oncogen.

Primaire kiemcellen van zoogdieren en mensen hebben een extragonadale oorsprong en vormen de bron voor de klonale ontwikkeling van de kiemcellijn. De oorsprong van de primordiale kiemcellijn, evenals alle embryonale weefsels en het extra-embryonale mesoderm, is de epiblast (primair ectoderm) van vroege embryo's, die een mozaïekstructuur heeft. Door middel van microchirurgische verwijdering van verschillende delen van het vroege embryo werd een lokalisatiezone in de epiblast van de kloon van toegewijde voorlopers van primordiale kiemcellen vastgesteld. Met behulp van rhodaminedextran, dat als celmarker werd gebruikt, werd vastgesteld dat de voorlopers van primordiale kiemcellen zich in het proximale deel van de epiblast bevinden, nabij het extra-embryonale ectoderm. De primordiale kiemcellijn ontstaat uit een kloon van 45 cellen, waarvan de allocatie plaatsvindt aan het begin van de gastrulatie. Vervolgens segregeert de kloon, en tijdens de gastrulatie komen de primaire kiemcellen het extra-embryonale mesoderm binnen en bevinden zich aan de basis van het rudiment van de allantois, achter de primaire streep. Van daaruit migreren de primaire kiemcellen naar het ventrale deel van het endoderm van de dikke darm en bewegen zich vervolgens actief langs het mesenterium, waar ze aan het einde van de migratie de genitale richels bevolken. Tijdens de migratie, evenals in de eerste 2-3 dagen van lokalisatie in het rudiment van de gonade, prolifereren de primaire kiemcellen actief en ondergaan acht replicatieve cycli. Als er aan het begin van de migratie ongeveer 50 primaire kiemcellen zijn, dan bedraagt het aantal primaire kiemcellen in de genitale richels van muizenembryo's van twaalf dagen ontwikkeling meer dan 25.000.

De functionele gelijkenis tussen ES-cellen en primordiale kiemcellen blijkt uit de volledige integratie van de laatste in de blastocyst met de vervanging van de interne celmassa en de daaropvolgende volledige ontwikkeling van het embryo, waarvan de weefsels uitsluitend bestaan uit de afstammelingen van de primordiale kiemcellen. Ook in andere opzichten bleken primordiale kiemcellen van muizen identiek aan ES-cellen, wat aantoont dat ze in diverse richtingen kunnen differentiëren, in vitro embryonale lichamen kunnen vormen en in vivo teratomen kunnen vormen bij subcutane toediening aan immunodeficiënte muizen, wat lijkt op spontane testiculaire teratomen bij 129/ter muizen.

Er werd gevonden dat wanneer LIF, membraangebonden en oplosbare SIF aan het medium worden toegevoegd, geïsoleerde primaire kiemcellen van 8 dagen oude muizenembryo's overleven en zich 4 dagen lang in de kweek voortplanten, maar vervolgens sterven. Bovendien valt de periode waarin de dood van primaire kiemcellen in de kweek wordt waargenomen samen met het ontwikkelingsstadium van muizenembryo's (12,5-13,5 dagen) waarin vrouwelijke primaire kiemcellen meiose ingaan in de rudimenten van de gonaden en mitotische delingen in mannelijke primaire kiemcellen worden geblokkeerd. Als echter niet alleen de groeifactoren LIF en SIF, maar ook FGF2 aan het medium worden toegevoegd, blijven de primaire kiemcellen prolifereren en worden er in de subculturen kolonies cellen gevormd die zich kunnen vermenigvuldigen, zelfs nadat de groeifactoren (SIF en FGF) uit het medium zijn verwijderd. Dergelijke cellen kunnen langdurig worden gekweekt op een substraat van embryonale fibroblasten zonder toevoeging van de oplosbare groeifactor LIF. Er werd voorgesteld om deze stabiele cellijnen, verkregen uit primordiale kiemcellen, embryonale kiemcellen te noemen. Deze term is echter niet succesvol, aangezien het onmogelijk is om embryonale kiemcellen te verkrijgen die in staat zijn om latere stadia van oögenese of spermatogenese uit te voeren bij het kweken van EG-cellen. Dit komt doordat EG-cellijnen, hoewel ze afkomstig zijn van primordiale kiemcellen, in kweek de eigenschappen van embryonale pluripotente stamcellen verkrijgen, maar hun vermogen om zich aan kiemlijnen te binden verliezen. Met andere woorden, primordiale kiemcellen verliezen bij kweek de eigenschappen van gametenprecursoren en worden getransformeerd tot ESC-achtige pluripotente cellen.

Er is vastgesteld dat er geen teratomen ontstaan wanneer EG-cellen worden geïntroduceerd in immunodeficiënte muizen. Aangenomen wordt dat het verlies van het vermogen van menselijke EG-cellen om teratomen te vormen te wijten is aan het feit dat deze lijnen niet rechtstreeks zijn ontstaan uit gekweekte primaire kiemcellen, maar zijn verkregen uit cellen geïsoleerd uit embryonale lichamen. Het is daarom mogelijk dat ze afstammen van pluripotente, maar reeds gecommitteerde cellen.

Er zijn fundamentele verschillen tussen EG-cellen en primordiale kiemcellen. Met laatstgenoemde kunnen geen chimere muizenembryo's worden verkregen, wat wijst op het gebrek aan vermogen van primordiale kiemcellen om te integreren in de binnenste celmassa of het trofectoderm. De kenmerken van de primordiale kiemcelpopulatie lijken meer op die van toegewijde lijnen van somatische cellen van latere embryo's, waarvan de introductie in de blastocyst eveneens niet leidt tot de vorming van chimere embryo's.

Modificatie van de kweektechniek voor embryonale lichamen, verkregen door aggregatie van EG-cellen, maakte het mogelijk om een andere populatie pluripotente cellen te verkrijgen, genaamd "embryo-lichaam-afgeleide cellen" (EBD-cellen), door middel van selectie op selectieve media. Het vermogen van EBD-cellen om langdurig in kweek te prolifereren, maakte het mogelijk om stabiele cellijnen van toegewijde cellen te creëren. Er werden klonen verkregen van cellen die een breed scala aan mRNA- en eiwitmarkers van gespecialiseerde cellen tot expressie brachten. Deze aanpak bewees uiteindelijk dat menselijke primaire kiemcellen pluripotent zijn en in vitro differentiëren tot verschillende celtypen: neuronen, neuroglia, vasculair endotheel, hematopoëtische cellen, spiercellen en endodermale cellen.

Alternatieve bronnen van embryonale stamcellen

Een alternatieve bron van menselijke ESC-lijnen kunnen hybride cellen zijn. Implantatie in de baarmoeder van pseudodrachtige koeien van een heterogeen construct, verkregen door fusie door elektroporatie van somatische cellen van de menselijke foetus met een eicel van een koe waarvan de pronucleus vooraf is verwijderd, maakt het mogelijk om een interne celmassa te verkrijgen uit een kunstmatig embryo in een ontwikkelingsstadium vóór de implantatie. Hiervoor wordt in het eerste stadium een blastocyst verkregen uit een eicel van een koe met een getransplanteerde menselijke celkern.

In het tweede stadium wordt een embryoblast geïsoleerd uit de blastocyst, en daaruit worden ESC's geïsoleerd met behulp van de Thomson-methode. Het is opmerkelijk dat de beste resultaten bij het isoleren van ESC-lijnen met deze methode werden verkregen met behulp van kernen van folliculaire cellen of primaire kiemcellen die in het menselijk lichaam in winterslaap blijven. Dit komt doordat de kernen van menselijke cellen die in een koeieneicel worden getransplanteerd, niet-verkorte telomeren en een hoge telomeaseactiviteit moeten hebben, wat helpt bij het voorkomen van vroegtijdige veroudering van ESC-klonen die uit een hybride eicel zijn verkregen (Repin, 2001). Het is bekend dat de belangrijkste intracellulaire markereiwitten van ESC's Oct3, Oct4, Tcf en Groucho zijn, die behoren tot de zogenaamde chromatin silencer-eiwitten. Silencers zorgen voor een bijzonder compacte heterochromatine-pakketvorming, die de vorming van euchromatine-lussen voorkomt. De door deze eiwitten gemedieerde chromatine-verpakking correleert met de totipotentie van het ESC-genoom. Tot op heden is vastgesteld dat volwassen oöcyten van runderen en mensen het enige type gespecialiseerde cellen zijn met hoge concentraties silencer-eiwitten in het cytoplasma. Op basis hiervan is een methode ontwikkeld om hybride ES-cellen te verkrijgen door somatische celkernen over te brengen naar ontkernde oöcyten van runderen. Voorlopige in-vitrostudies hebben aangetoond dat het cytoplasma van oöcyten van runderen de totipotentie van het genoom van de somatische celkern van de mens herstelt na 12-24 uur kweek.

Van bijzonder belang zijn de gegevens over de bijzonderheden van de pre-implantatieontwikkeling van menselijke embryo's, die wijzen op een latere vervanging van totipotente cellen door een populatie pluripotente cellen dan bij muizen. Een onderzoek naar cellulaire transformaties toonde aan dat trofoblastcellen, naast ES-cellen, ook ontstaan uit de cellen van de binnenste celmassa van menselijke blastocysten, wat wijst op hun totale potentie.

Het is bekend dat in het blastocyststadium twee verschillend gecommitteerde celpopulaties ontstaan. Eén daarvan vormt de buitenste laag van de blastocyst - het trofectoderm, waarvan de trofoblastcellen en andere embryonale componenten van de placenta de afgeleiden zijn. De tweede celpopulatie is gegroepeerd in een dichte massa die contact maakt met het binnenoppervlak van het trofectoderm. De afgeleiden van de celpopulatie van de binnenste celmassa zijn alle weefsels en rudimenten van de organen van het embryo. In het stadium van de late blastocyst wordt het extra-embryonale endoderm gevormd uit de binnenste celmassa en wordt de epiblast (primair ectoderm) gevormd. In dit geval behouden de epiblastcellen hun pluripotentie, terwijl het vermogen om cellen van het extra-embryonale endoderm te differentiëren beperkt is.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Het verkrijgen van menselijke embryonale stamcellen

Tot voor kort dacht men dat het onmogelijk was om ES-cellen uit trofoblasten te verkrijgen. Een lijn diploïde trofoctodermstamcellen, geïsoleerd uit een blastocyst, prolifereert echter en transformeert tot stamcellen in een medium met FGF2 en heparine in plaats van LIF. Als FGF2 uit het medium wordt verwijderd, stoppen trofoctodermcellen met vermenigvuldigen, begint de chromosoom-endoreduplicatie in hen en transformeren trofoctodermcelelementen geleidelijk tot gigantische trofoblastcellen. Waarschijnlijk stimuleert LIF de proliferatie van trofoctodermcellen niet, omdat FGF2 een ander transsignaleringsmechanisme activeert: FGF2, dat zich bindt aan de plasmareceptor (FGFR2), activeert MAP-kinases in het cytoplasma - ERK1 en ERK2. Wanneer een signaalroute (LIF - gpl30 - JAK-kinase - STAT3) in blastocystcellen wordt ingeschakeld, worden de cellen van de binnenste celmassa getransformeerd tot pluripotente ES-cellen, en wanneer het tweede mechanisme van transmembraansignaaltransductie (FGF2 - FGFR2 - MAP-kinase ERK1/ERK2) wordt geactiveerd, worden trofectodermstamcellen gevormd in de blastocyst. De keuze van de signaalroute hangt op zijn beurt af van de activiteit van het oct4-gen. Dit gen, dat tot het POU-domein behoort, bevindt zich in de t-locus van autosoom 17 en wordt tot expressie gebracht tijdens de oögenese, tijdens de delingsperiode, alsook in de cellen van de binnenste celmassa van de blastocyst en in de primaire kiemcellen. De functionele rol van het oct4-gen is het coderen van een transcriptiefactor die nodig is voor het ontstaan van pluripotente cellen, hun differentiatie en dedifferentiatie.

De expressie van het oct4-gen in ESC's varieert afhankelijk van de interactie van deze transcriptiefactor met cofactoren. Gerichte regulatie van de oct4-expressie in blastocysten toonde aan dat bij verminderde activiteit de helft van de cellen trofectoderm vormt, terwijl bij toename van de geïnduceerde oct4-expressie voornamelijk ESC's ontstaan.

In het experiment kunnen ESC's niet in een lijn worden overgebracht tijdens de kweek van totipotente blastomeren in het delingsstadium, noch in het gastrulatiestadium en latere stadia van de embryonale ontwikkeling. Muizen-ESC's worden gewoonlijk geïsoleerd op de 3,5-4,5e dag van de dracht, wat overeenkomt met het zesde (enkellaagse blastocyst) en zevende stadium (tweelaagse blastocyst - vroege eicelcilinder) van de normale embryogenese. Uiteraard bevatten muizenembryo's alleen in de pre-implantatieperiode celpopulaties die in staat zijn om te transformeren tot ESC's. Bijgevolg is de isolatie van ESC-lijnen alleen mogelijk in bepaalde stadia van de embryogenese. De zygote en blastomeren die tijdens de deling ontstaan, zijn totipotent, vanuit het oogpunt van de mogelijkheid om een levensvatbaar embryo met embryonale membranen en placenta te ontwikkelen. Het verlies van totale potentie van kiemcellen begint in het late morulastadium, wanneer verdere inzet van blastomeren afhankelijk is van hun locatie. Vroege morula-blastomeren behouden totipotentie, aangezien experimentele manipulaties met veranderingen in hun lokalisatie, zoals inversie van hun locatie, de ontwikkeling van een volwaardig embryo niet verhinderen.

Het is vastgesteld dat de efficiëntie van het isoleren van ES-cellen in een cellijn wordt beïnvloed door de conditie van de blastocysten op het moment van explantatie. Het gebruik van blastocysten na het modelleren van een zevendaagse diapauze in het voortplantingsstelsel van muizen die op de 3,5e dag van de dracht een ovariëctomie ondergingen en progesteron toegediend kregen, vergemakkelijkt een succesvollere isolatie van embryonale stamcellijnen. Aangenomen wordt dat onder dergelijke omstandigheden het aantal blastomeren dat de interne celmassa vormt, toeneemt. Het is ook mogelijk dat de celcyclus wordt verlengd en dat de meeste blastomeren de G0-fase ingaan.

Bovendien is de creatie van stabiele pluripotente ESC-lijnen afhankelijk van het genotype van de embryo's: ESC's zijn vrij eenvoudig te isoleren uit blastocysten van de 129-muizenlijn, ze zijn veel moeilijker te verkrijgen met CS7BL/6-muizen, en het is vrijwel onmogelijk om een ESC-lijn te isoleren uit blastocysten van CBA/Ca-muizen. Vroege embryo's hebben uiteraard enkele genetische kenmerken die de ontwikkeling van een pluripotente ESC-lijn beïnvloeden. Desondanks werden ESC-lijnen, zowel bij het kweken van geïsoleerde epiblasten als door selectieve selectie van differentiërende cellen, toch geïsoleerd uit vroege embryo's van CBA/Ca-muizen.

Een bewezen standaardtechniek voor het verkrijgen van ESC-lijnen uit blastocysten wordt beschreven in laboratoriumhandleidingen over de techniek van experimenten met vroege embryo's. Experimentele ESC-lijnen kunnen ook worden verkregen door geïsoleerde epiblast (primair ectoderm) van 4,5 dagen oude muizenembryo's te kweken met behulp van een vrij complexe microchirurgische techniek en aangepaste kweekomstandigheden. De arbeidsintensiviteit van deze procedure is gerechtvaardigd, aangezien de frequentie van ESC-lijnvorming in dit geval aanzienlijk hoger bleek te zijn dan bij werk met de binnenste celmassa van de blastocyst.

Om ESC-lijnen te isoleren, wordt elke kloon overgebracht naar een microwell, wordt een aggregaat van 40-60 cellen gekweekt en vervolgens weer verspreid. Meerdere herhalingen van deze procedure stellen ons in staat om een geïmmortaliseerde ESC-lijn te verkrijgen met de maximale proliferatiesnelheid van normokaryotypische cellen die aan plastic zijn gehecht, en die na 50-100 passages hun totipotentie en hoge telomerase-activiteit behouden. Bij het in stand houden van ESC-lijnen is het grootste gevaar besmetting van het medium of serum met bacteriële endotoxinen - zelfs sporenconcentraties van endotoxine in het kweekmedium veroorzaken massale sterfte van onrijpe kiemcellen. Met zorgvuldige monitoring van de lineaire groei en tijdige verspreiding zijn ESC's in kweek in staat tot symmetrische deling, waarbij beide dochtercellen pluripotent blijven en een onbeperkt aantal celcycli kunnen doorlopen, met behoud van een diploïd karyotype en totale potentie.

Selectie van een zuivere populatie menselijke ES-cellen kan worden uitgevoerd na transfectie van hun genoom met recombinante DNA-moleculen die het gen bevatten dat codeert voor de synthese van groen fluorescerend eiwit (GFP). De GFP-expressie neemt toe wanneer ES-cellen worden gekweekt onder omstandigheden die hun proliferatie ondersteunen, terwijl de expressie van dit gen afneemt bij het begin van de differentiatie, wat selectie van zuivere, stabiele pluripotente cellijnen op een selectief medium mogelijk maakt. Bij het kweken van ES-cellen die geïsoleerd zijn met behulp van GFP-selectie, neemt de frequentie van kolonievorming vele malen toe, omdat het krachtige antiproliferatieve effect van gedifferentieerde cellen wordt geëlimineerd onder de omstandigheden van selectieculturen.

De translatie van humane embryonale stamcellen naar een lijn wordt uitgevoerd door middel van isolatie uit pre-implantatie-embryo's (in het stadium van 80-120 cellen), die overblijven na de in-vitrofertilisatieprocedure. Hiervoor worden kunstmatig verkregen "overtollige" embryo's mechanisch gedispergeerd in het Delbecco-Eagle medium. Nadat de cellen zijn gelabeld met selectieve monoklonale antilichamen met een fluorescerend label, worden de embryoblastcellen geïsoleerd. De embryoblast wordt gedispergeerd in individuele cellen met behulp van een dispase-collageenasemengsel. De gedissocieerde cellen worden gekweekt in een speciaal medium (80% Delbecco's medium + 20% foetaal kalfsserum in aanwezigheid van 500 μg/ml IL-6, LIF en SCF) boven een monolaag van embryonale fibroblasten van de eerste 3 passages. In dit geval wordt de overleving en proliferatie van stam- en progenitorcellen behouden dankzij het effect van IL-6, LIF en SCF. In een dergelijk medium groeien ES-cellen als suspensieklonen van losse, bolvormige cellen, die door zachte, herhaalde pipettering van elkaar moeten worden gescheiden. Nieuwe klonen verschijnen op dag 5-7 in de suspensiekweek. De maximale groeisnelheid van ES-cellen wordt bereikt door herhaalde dissociatie van klonen in het stadium van 10-15 cellen. Vervolgens wordt elke kloon overgebracht naar een microwell en gekweekt tot een aggregaat van 40-50 cellen. De procedure wordt vele malen herhaald in passages, waarbij het volume van de kweek toeneemt tot een dichtheid van 5-10 miljoen cellen per schaal van 6 cm. Met behulp van deze passage isoleerde Thomson 10 onsterfelijke klonen van menselijke ES-cellen, die na 100 passages een hoge telomeraseactiviteit, het vermogen om krachtig te prolifereren, minimale fenotypische kenmerken en totale potentie behielden met het vermogen om te differentiëren tot elk van de 350 gespecialiseerde cellijnen afkomstig van het ecto-, meso- en endoderm. De differentiatie van humane ES-cellen begon (na mediumverandering, toevoeging van serum en eliminatie van LIF) met celhechting aan het substraat, wat wijst op de ontwikkeling van het cytoskelet en de expressie van adhesiereceptoren. Belangrijk is dat humane ES-cellen, met onbeperkte proliferatie, een normaal karyotype behielden.

De tweede methode voor het isoleren van menselijke ESC-lijnen is gebaseerd op het gebruik van primaire kiemcellen. Experimentele studies hebben aangetoond dat E-cellijnen kunnen worden verkregen uit de genitale plooien van 12,5 dagen oude muizenembryo's. In deze gevallen was de frequentie van de vorming van progenitorcellijnen echter significant lager dan in experimenten met eerdere embryo's. Tegelijkertijd zijn primaire kiemcellen uit de gonaden van muizenembryo's met een zwangerschapsduur van 13,5 dagen helemaal niet in staat om te transformeren tot lijnen.

De eerste stabiele lijnen van pluripotente humane EG-cellen werden verkregen uit primaire gonocyten geïsoleerd uit de gonaden van 5-9 weken oude embryo's. De geïsoleerde cellen werden gekweekt op een substraat van geïnactiveerde muizenembryonale fibroblasten in DMEM-medium met foetaal serum aangevuld met mercaptoethanol, forskoline en recombinante humane groeifactoren (FGF en LIF). Na 7-12 dagen verschenen er multicellulaire kolonies in de kweek, die qua morfologische kenmerken en moleculaire markers overeenkwamen met humane EG-cellen. Na aggregatie vormden deze cellen embryonale lichamen, waarna zich gespecialiseerde cellen ontwikkelden die kenmerkend waren voor derivaten van alle drie de kiembladen. Na 10-20 passages behielden de EG-cellijnen een normaal karyotype en verloren ze hun pluripotentie niet.

Er is ook aangetoond dat de gecombineerde werking van LIF, membraangebonden en oplosbare Steel-factoren en TGF-β het ontwikkelingsprogramma van primordiale kiemcellen verandert. In plaats van de mitotische delingen te stoppen en te beginnen met differentiëren richting oögenese of spermatogenese, blijven primordiale kiemcellen prolifereren. Na enkele extra mitotische cycli gaan ze lijken op epiblastcellen en, doordat ze de eigenschappen van kiemcelprecursoren verliezen, transformeren ze tot pluripotente embryonale stamcellen (EG).

Zo werden in 1998 voor het eerst geïmmortaliseerde lijnen van primordiale kiemcellen geïsoleerd uit het genitale rudiment van menselijk foetaal autopsieweefsel. Bij de menselijke embryogenese verschijnen primordiale kiemcellen in de derde week van de ontwikkeling in de dooierzak en in de vierde en vijfde week migreren deze cellen naar de genitale tuberkelzone, waar ze slapende populaties van primaire gonocyten vormen. In een inactieve toestand blijven primordiale kiemcellen in het embryo bewaard tot de geboorte. Lijnen van primordiale kiemcellen worden geïsoleerd uit de foetale genitale tuberkel van embryo's van 5-9 weken, waarvan het geëxtraheerde weefsel ex tempore wordt behandeld met een mengsel van collagenasen type IV-V, hyaluronidase en DNase om de kwantitatieve en kwalitatieve celopbrengst te verhogen. Primordiale kiemcellen in het weefsel van de foetale genitale tuberkel worden omgeven door stromale (mesenchymale) Sertolicellen. Het functionele doel van Sertoli-cellen is de productie van anti-apoptotische factoren (Fas-ligand), mitogenen en immunosuppressiva die kiemcellen beschermen tegen immuunaanvallen door het lichaam. Daarnaast speelt de stromale micro-omgeving van de genitale tuberkel een belangrijke rol bij de rijping van gameten. De geïsoleerde primaire kiemcellen worden in kweek geplant boven een voedende stromale laag bestaande uit foetale fibroblasten van de eerste drie passages. De meest effectieve combinatie van mitogenen is een complex bestaande uit LIF, FGF en forskoline (een stimulator van cAMP-vorming). Proliferatie van primaire kiemcellen in vitro vereist de toevoeging van foetaal serum, in aanwezigheid waarvan de reproductie van primaire gonocyten in kweek gepaard gaat met de vorming van klonen van bolvormige cellen die niet aan het substraat vastzitten.

De National Institutes of Health (VS) hebben op basis van een samenvatting van de bestaande gegevens over methoden voor het isoleren van humane ESC-lijnen uit blastocysten een voorlopige conclusie getrokken dat succesvolle isolatie van ESC's het meest waarschijnlijk is bij het kweken van blastocysten met een goed gevormde binnenste celmassa (Stem cells: scientific progress and future research direction. Nat. Inst. of Health USA). Vanuit dit oogpunt zijn humane blastocysten op de vijfde dag van hun ontwikkeling de optimale bron van ESC's voor het creëren van lijnen. Bij het isoleren van de binnenste celmassa moet het trofectoderm zorgvuldig worden verwijderd. De geïsoleerde binnenste celmassa, die in dit stadium uit 30-35 cellen bestaat, moet worden gekweekt op een substraat van embryonale muizenfibroblasten. Dit is een doorslaggevende voorwaarde voor de vorming van ESC-kolonies in kweek.

Analyse van fenotypische kenmerken van embryonale stamcellen

Van bijzonder belang is de interspeciesvergelijkende analyse van de fenotypische kenmerken van ESC's. Er werd vastgesteld dat menselijke ESC-kolonies dichte clusters zijn van afgeplatte, epitheelachtige cellen, terwijl embryonale lichamen van muizen bestaan uit een los conglomeraat van ronde cellen. Bij menselijke ESC's is de kern-plasma-ratio-index lager dan bij muizen-ESC's. Embryonale stamcellen van apen vormen plattere celkolonies met ongelijke randen. Individuele cellen zijn gemakkelijk zichtbaar in vroege klonen van ESC's van primaten. Prolifererende ESC's van alle bestudeerde diersoorten brengen geen MHC-klasse I- en II-moleculen tot expressie. Tegelijkertijd reageren menselijke ESC's positief op TERA 1-60- en GCTM-2-antilichamen, wat wijst op de aanwezigheid van keratine-/chondroïtinesulfaatproteoglycanen op hun oppervlak, kenmerkend voor embryo-(terato)-carcinoomstamcellen. Expressie van het oct4-gen in ES-cellen van alle diersoorten suggereert dat, ondanks fenotypische verschillen, dezelfde set genen die verantwoordelijk zijn voor het behoud van pluripotentie blijkbaar wordt geactiveerd in ES-cellen van mens en muis (Peru, 2001). Bovendien vertonen ES-lijnen geïsoleerd uit ratten-, varkens-, konijnen-, primaten- en runderembryo's vergelijkbare morfologische kenmerken, een vergelijkbare set moleculaire identificatiemarkers en een vrijwel identiek moleculair mechanisme voor de implementatie van embryogeneseprogramma's, wat ons een nieuwe kijk biedt op het probleem van xenotransplantatie.

In tegenstelling tot normale embryogenese in vivo, gaat de proliferatie van ES-cellen in vitro niet gepaard met de vorming van kiembladen en vindt plaats tegen de achtergrond van blokkering van homeotische Hoxgenen, d.w.z. zonder organogenese. Omdat de segmentatiegenen niet functioneren, is het onmogelijk om perioden van embryogenese zoals het leggen van somieten, embryosegmentatie, vorming van de dooierzak, allantois en andere voorlopige organen en weefsels te reproduceren in ESC-kweek. Gekweekte ES-cellen lijken te zijn bevroren aan het begin van het proces van de vorming van 350 restrictielijnen van gespecialiseerde cellen. Een kloon van dochterprogenitorcellen en een centraal gelokaliseerd ES-cel vertegenwoordigen dus slechts een model van een embryo, tijdens de ontwikkeling waarvan verschillende lijnen van gespecialiseerde cellen gelijktijdig worden gevormd in verschillende weefselregio's, die echter afkomstig zijn van gemeenschappelijke voorlopercellen. Ondanks het minimale aantal receptoren op het oppervlak van ES-cellen, behouden ze het vermogen om primitieve morfogenetische processen uit te voeren, waarbij ze de volumetrische structuren van een vroeg embryo imiteren: een suspensie van ES-cellen in kweekaggregaten vormt structuren die lijken op blastocysten of zelfs latere embryo's (eicelcilinders). Dergelijke suspensieaggregaten worden respectievelijk eenvoudige en complexe embryonale lichamen genoemd.

Bij gemengde differentiatie worden vroege genen van het ectoderm (oct3, fgf-5, nodaal), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), cardiogeen mesoderm (pkh-2.5), neurale buis (msx3) en hematopoëse (elkf) gelijktijdig tot expressie gebracht in verschillende cellen van één embryonale corpus. Door verschillende combinaties van groeifactoren en cytokinen te gebruiken voor gerichte inwerking op de vorming van kiembladcellen in vitro, was het in een aantal gevallen mogelijk om embryonale corpusen te verkrijgen waarin ectoderm- of mesodermgenen preferentieel tot expressie kwamen, wat de weg opent naar het modelleren van gastrulatie en de eerste fasen van organogenese.

De klonale groei van ES-cellen wijst op asymmetrische celdeling, waarbij slechts één ES-cel in het centrum van de kloon een onbeperkt proliferatiepotentieel behoudt, terwijl de tweede dochtercel een generatie progenitorcellen genereert die al differentiatie ondergaan. Daarom is de proliferatiesnelheid van de kloon aan de periferie van het embryonale lichaam hoger dan in het centrum. De marginale cellen van de groeiende kloon ondergaan spontane, ongeordende differentiatie, migreren of sterven door apoptotische mechanismen. Deze gebeurtenissen bepalen het lot van de kloon: als de proliferatiesnelheid de snelheid van migratie en apoptotische celdood overschrijdt, blijft de kloon in omvang toenemen, vindt stabilisatie plaats wanneer de apoptosesnelheid en de snelheid van nieuwe celvorming gelijk zijn, en treedt regressie op wanneer de verhouding tussen deze processen omgekeerd is. Progenitorcellen delen symmetrisch, d.w.z. beide dochtercellen differentiëren vervolgens tot volwassen, gespecialiseerde cellijnen. De verhouding tussen ES-cellen en voorlopercellen varieert, maar het aantal ES-cellen is altijd slechts een fractie van een procent van de populatie voorlopercellen. Daarom kan alleen zorgvuldig pipetteren en tijdige disaggregatie van klonen het aantal ES-cellen in de kweek verhogen. Disaggregatie van klonen in het stadium van 10-12 cellen bleek het meest effectief voor het verkrijgen van een maximale opbrengst aan ES-cellen. De richting en mate van differentiatie van cellen in het embryonale lichaam hangt af van hun locatie. De buitenste cellen van het embryonale lichaam brengen het oct4-gen niet tot expressie en differentiëren tot cellen van het primaire endoderm, waaruit vervolgens epitheelachtige cellen van het pariëtale en viscerale extra-embryonale endoderm worden gevormd. De binnenste cellen van het embryonale lichaam brengen het oct4-gen tot expressie en behouden pluripotentie gedurende 48 uur kweek. De kweek wordt vervolgens echter morfologisch geherstructureerd tot een epitheliale monolaag en de expressie van genen die de ontwikkeling van het primaire ectoderm controleren, begint. Vervolgens begint het proces van totale ongeordende cytodifferentiatie met het verschijnen van verschillende celtypen die afgeleiden zijn van alle drie de kiembladen. Tijdens het proces van spontane differentiatie van de cellen van het embryonale lichaam verschijnen als eerste aggregaten met endodermmarkers in de vorm van fragmenten (cysten) van de dooierzak. Vervolgens verschijnen in deze structuren angioblasten en endotheelcellen van de groeiende haarvaten. In de laatste stadia van spontane differentiatie ontwikkelen zich verschillende terminaal gedifferentieerde cellen uit de interne cellen van het embryonale lichaam, waaronder neuronen, gliale elementen, cardiomyocyten, macrofagen en erytrocyten. Tot op zekere hoogte (rekening houdend met de ruimtelijke inversie van de vorming van de kiemweefsellagen) is het met behulp van embryonale lichaampjes mogelijk om morfogenetische processen in vitro te bestuderen en de moleculaire mechanismen van de beginfasen van embryonale cytodifferentiatie te analyseren.en om de rol van specifieke genen bij de uitvoering van deze processen vast te stellen.

Binnen de kloon bevinden zich dus cellen waarin verschillende genetische ontwikkelingsprogramma's zijn ontdekt - ES-cellen, vroege voorlopercellen en differentiërende voorloperpopulaties. Het kweken van ES-cellen met behulp van de hangende druppel- of massacultuurmethoden zonder een voedingslaag en zonder toevoeging van LIF aan het medium leidt onvermijdelijk tot de vorming van embryonale lichamen. De morfologie van de cellen van de buitenste en binnenste lagen van embryonale lichamen verschilt. De buitenste laag bestaat uit grote, vertakte cellen. Hun oppervlak, gericht naar de omgeving, is bedekt met talrijke microvilli. De buitenste laag cellen is van de binnenste laag gescheiden door een basaalmembraan dat lijkt op het membraan van Reichert, terwijl de cellen van de binnenste laag van embryonale lichamen cilindrisch epitheel zijn. Morfologisch gezien lijkt de binnenste laag, hoewel deze veel delende cellen bevat, meer op ongedifferentieerde kolonies van ES-cellen.

Kenmerken van menselijke embryonale stamcellen

De afwezigheid van parenchymateuze-mesenchymale signaalinteracties tegen de achtergrond van homeose-genblokkering leidt tot een ongeordende groei van ES-cellen in kweek, aangezien dit de vorming en ontwikkeling van de infrastructuur van voorlopige organen verstoort. Gedesorganiseerde groei en ongeordende spontane differentiatie van ES-cellen in kweek zijn te wijten aan de afwezigheid van mesenchymale markering in het stroma van toekomstige organen: in vitro is het heel goed mogelijk om miljoenen hepatocyten te vormen, maar het is onmogelijk om één enkele leverlobe te verkrijgen die structurele en functionele elementen zoals sinussen, disseruimten en Kupffer-cellen bevat.

Er wordt aangenomen dat de pluripotentie van ESC's uitsluitend wordt gerealiseerd in de embryogenese met de vorming van weefsels en organen van het embryo, terwijl de placenta en de navelstreng derivaten zijn van de trofoblast. ESC's ingesloten in het trophectodermale membraan genereren sequentieel klonen van voorlopige cellen die het ontwikkelingsprogramma implementeren via het combinatorische mRNA van de volumetrische topografische matrix van Nokhteyov, die de ruimtelijke indeling, vorm en grootte, het aantal cellen van voorlopige en definitieve organen, evenals de assemblage van het parenchym in structurele en functionele eenheden vooraf bepalen. Tegelijkertijd blijven ESC's het enige type cellen waarin het moleculaire mechanisme voor de implementatie van hun potenties volledig is losgekoppeld van het genetische ontwikkelingsprogramma, en de ESC's zelf zijn verstoken van het vermogen om te interageren met andere cellen vanwege de blokkering van zowel receptorpercepties als transsignaleringssystemen. Adequate activering van ES-cellen leidt echter tot een stapsgewijze ontwikkeling van het embryogeneseprogramma, eindigend met de geboorte van een volledig gevormd organisme, bestaande uit miljarden cellen, klaar voor het leven buiten de baarmoeder. Op dit korte, maar onvoorstelbaar lange pad in de cellulaire ruimte ontstaan onvermijdelijk fouten, zowel in de moleculaire mechanismen die de vitale activiteit van cellen garanderen als in de programma's die hun proliferatie, differentiatie en specialisatie controleren. Daarom worden in de moderne farmacogenomica ziekten van de moleculaire structuur en ziekten van de celprogrammering afzonderlijk beschouwd. Bovendien is de werking van de meeste nieuwe geneesmiddelen gericht op het corrigeren van de programma's van differentiatie, proliferatie en organogenese, evenals op de regeneratie van organen en weefsels. In een volwassen organisme maken ES-cellen het mogelijk om het gedrag van stam-/voorlopercellen die getransplanteerd zijn in de hersenen, lever, milt, beenmerg en andere menselijke organen te controleren om beschadigd parenchym van de organen van de ontvanger te herstellen door donorcellen te differentiëren en te specialiseren op de bewaarde mesenchymale matrix. In essentie begint het totipotentieprogramma zich te ontwikkelen op het niveau van het genoom van de oöcyt, de zygote en het blastomeer; deze cellen zijn echter nog niet gekloond en gepasseerd in de hoeveelheden die nodig zijn voor de experimentele en praktische geneeskunde. ESC's blijven daarom een unieke bron van genetische informatie, met codes voor een driedimensionale kaart van het embryo en codes voor lineaire restrictie van gespecialiseerde cellijnen tijdens gastrulatie.

Het vrijwel onbegrensde regeneratieve potentieel van ES-cellen is te danken aan het feit dat hun genoom, in tegenstelling tot het genetische apparaat van gedifferentieerde somatische cellen, pluripotentie behoudt. Een van de manifestaties van de slapende toestand van de genetische informatie die in ES-cellen is ingebed, is het zogenaamde minimale fenotype - een beperkt aantal receptoren wordt tot expressie gebracht op het oppervlak van ES-cellen, en dienovereenkomstig worden er zeer weinig transsignaleringsprogramma's ingezet voor de interactie tussen het nucleaire apparaat van de cel en zijn micro-omgeving. Tegen de achtergrond van de winterslaap van genen die verantwoordelijk zijn voor de beperking van gespecialiseerde cellijnen en celdifferentiatie, worden slechts ongeveer 30 van de 500 genen geactiveerd, waarvan de producten zorgen voor de verbinding van de cel met de omringende micro-omgeving. Met behulp van seriële analyse van genexpressie werd aangetoond dat, met de gezamenlijke werking van de belangrijkste functionele compartimenten van het genoom die de energetica en het metabolisme in somatische cellen en ESC's reguleren, deze laatste een zeer laag mRNA-gehalte hebben van receptoren, G-proteïnen, secundaire boodschappers, transcriptasen, expressie- en repressiecofactoren, d.w.z. het gehele systeem van transmembraantransmissie van het regulerende signaal naar de cel. Dit komt door de afwezigheid of zeer lage expressie van transsignalerende genen. Tijdens de periode van geïnduceerde differentiatie in het ESC-genoom stoppen 18 functionerende genen synchroon met werken tegen de achtergrond van de activering van 61 transsignalerende genen die de synthese van celadhesiereceptoren, componenten van de extracellulaire matrix, restrictietranscriptasen en boodschapperelementen van het signaaltransmissiesysteem naar het nucleaire apparaat vanuit de receptoren van het celplasmamembraan reguleren. Tegelijkertijd wordt de expressie van genen die verantwoordelijk zijn voor de synthese van silencer-eiwitten geblokkeerd, evenals co-remmers van genexpressie die de totipotentie van het ESC-genoom garanderen.

Er zijn genmarkers gevonden voor cellen van alle drie de kiembladen. Identificatie van de ectodermale cellaag vindt plaats door de expressie van de genen nodale, oct3 en fgf-5, van mesodermcellen door de genen voor brachyury en zetaglobine, en van endoderm door de expressie van het gen voor gata-4. Tijdens normale embryogenese wordt tijdens de gastrulatieperiode actieve migratie van onrijpe populaties stam- en voorlopercellen waargenomen, waarbij lokaal de ontwikkelingszones van de gezichtsbeenderen van de schedel, sommige delen van de hersenen, het perifere zenuwstelsel, het hartgeleidingssysteem en de thymus worden gemarkeerd, waarvan de weefsels gevormd zijn uit klonen van migrerende cellen. Het markeren van cellen door vroege genen van de kiembladen vergemakkelijkt de topografische analyse van de migratieprocessen van voorlopercellen in het zich ontwikkelende embryo. Met name is vastgesteld dat in aggregaten van P19-embryocarcinoomcellen de expressie van het eerste mesodermgen brachyury begint tijdens de periode van verminderde expressie van de genen van weefselplasminogeenactivator, a-foetoproteïne, keratine 8 en keratine 19, die markers zijn van de eerste migrerende mesodermpopulaties. Bijgevolg begint de vorming van weefsels van mesodermale oorsprong pas na voltooiing van het proces van puntmigratie en verspreiding van mesodermale voorlopercellen.

Ondanks extreem beperkte fenotypische kenmerken en de afwezigheid van de meeste transsignalering units, brengen ESC's nog steeds enkele receptormoleculen tot expressie die gebruikt kunnen worden voor hun identificatie. Het is opmerkelijk dat ESC-markerantigenen bij mensen en primaten veel voorkwamen. Meestal worden gelabelde antilichamen tegen membraangebonden antigenen SSEA-3 en SSEA-4 (unieke lipide-antigenen die een complex vormen van glycolipide GL7 met siaalzuur), evenals de hoog-polymeer glycoproteïnen TRA-1-81 en TRA-1-60, gebruikt voor ESC-labeling. Daarnaast brengen ESC's het specifieke embryonale antigeen SSEA-1 en endogene alkalische fosfatase tot expressie, evenals de specifieke transcriptiefactor Oct4. Deze laatste is noodzakelijk voor het in stand houden van de mechanismen van ESC-proliferatie - de specifieke transcriptiefactor Oct4 activeert de expressie van het fibroblastgroeifactor 4-gen en stabiliseert de expressie van de groep genen die verantwoordelijk is voor onbeperkte DNA-replicatie in onvolgroeide cellen. De belangrijkste intracellulaire markerproteïnen zijn Oct3, Oct4, Tcf en Groucho, die verwant zijn aan chromatine silencer-proteïnen.

Vrijwel direct nadat jarenlange pogingen om ESC's buiten het lichaam te kweken succesvol waren en de eerste culturen van stamcellen, geïsoleerd uit muizenblastocysten, en culturen van primaire kiemcellen werden verkregen, begon een fase in het onderzoek naar het pluripotente potentieel van ESC's toen ze in vroege stadia van ontwikkeling in embryo's werden geïntroduceerd. Er werd aangetoond dat ESC's in de morula- en blastocyststadia in staat zijn om chimere embryo's te vormen waarin de nakomelingen van donor-ESC's in alle somatische weefsels en zelfs in gameten worden gedetecteerd. Zo werd in de ontwikkelingsbiologie met behulp van ESC's een "brug" geslagen tussen experimentele studies in vivo en in vitro, wat de mogelijkheden voor het bestuderen van de processen van de aanmaak van primaire weefsels en organen, hun differentiatie en embryonale organogenese aanzienlijk uitbreidde.

Het is duidelijk vastgesteld dat ESC's in vivo tijdens de embryogenese worden geïntegreerd in de celmassa van het vroege embryo, en dat hun derivaten in alle organen en weefsels worden aangetroffen. ESC's koloniseren een lijn van kiemcellen in het chimere embryo, waarvan de nakomelingen volwaardige eicellen en spermacellen vormen. Embryonale stamcellen zijn klonogeen - één enkele ESC is in staat een genetisch identieke kolonie cellen te creëren met moleculaire markers, waaronder de expressie van het oct4-gen en alkalische fosfatase, hoge telomeraseactiviteit en de expressie van bepaalde embryonale antigenen.

Om de mechanismen van embryogenese met behulp van ESC's te bestuderen, is een methode van morulachimerisatie ontwikkeld. Hierbij wordt een biologisch construct gecreëerd met daarbuiten een laag ontvangende tetraploïde blastomeren, en worden donor-ESC's erin geïntroduceerd. Zo wordt de trofoblast gevormd uit de afstammelingen van de tetraploïde blastomeren van de ontvangende cel, wat zorgt voor implantatie en placentatie. Donor-ESC's fungeren als een interne celmassa waaruit het lichaam van een levensvatbaar embryo en een lijn van primaire voorloperkiemcellen worden gevormd. De onderzoekswaarde van ESC's ligt niet alleen in het feit dat hun pluripotentie behouden blijft tijdens in-vitromanipulaties met hun genoom, maar ook in het feit dat ESC's hun vermogen om deel te nemen aan de vorming van primaire kiemcellen van een chimeer embryo behouden. Aangetoond is dat de afstammelingen van slechts één genetisch gemodificeerd ESC alle primaire rudimenten en zich ontwikkelende weefsels van een chimeer embryo bevolken, verkregen door aggregatie of cocultivatie van deze cel met een achtcellig embryo. Toen ESC's, getransfecteerd met het gen voor groen fluorescerend proteïne, werden getransplanteerd in de morula van muizen, werden fluorescerende afstammelingen van deze cel aangetroffen in alle bestudeerde weefsels van het zich ontwikkelende embryo (Shimada, 1999). Transplantatie van ESC's in de morula maakt het mogelijk om levensvatbare muizen te creëren waarvan het organisme uitsluitend bestaat uit de afstammelingen van de donor-ESC, wat perspectieven opent voor diverse therapeutische kloneringsmogelijkheden. Deze methodologische aanpak wordt nu met succes gebruikt om ontwikkelingsbiologische problemen te bestuderen, met name om de mechanismen van genetische inactivatie van het X-chromosoom of epigenetische instabiliteit van ESC's te analyseren. Transplantatie van ESC's in een vroeg embryo wordt ook gebruikt in de landbouwbiotechnologie en bij gentherapie-experimenten.

Transplantatie van genetisch gemodificeerde ESC's wordt gebruikt om doelcellen van gemuteerde genen te testen. In vitro gekweekte ESC's worden in de biotechnologie gebruikt om knock-outmuizen te creëren. Hiervoor wordt het te bestuderen gen uit de ESC's verwijderd door homologe recombinatie (knock-out) en worden cellen waaraan dit gen ontbreekt geïsoleerd op selectieve media. Knock-out ESC's worden vervolgens in de blastocyst ingebracht of geaggregeerd met morulablastomeren. De chimere vroege embryo's die op deze manier worden verkregen, worden getransplanteerd in ontvangende vrouwtjes, en individuen met gameten die nullizygoot zijn voor een bepaald gen, worden geselecteerd uit de pasgeboren muizen. Deze technologie is gebruikt om vele lijnen van knock-outmuizen te creëren, die veel worden gebruikt in de experimentele biologie en experimentele geneeskunde. Dergelijke biologische modellen worden gebruikt om de betekenis van bepaalde genen in de embryonale ontwikkeling te bestuderen, evenals hun rol in de mechanismen van menselijke ziekten en pathologische aandoeningen. Daarnaast worden knock-outdierlijnen gebruikt bij het preklinisch testen van nieuwe gentherapiemethoden. Door bijvoorbeeld het normale allel van een mutant gen te transfecteren in het ESC-genoom, is het mogelijk om een mutatie die het hematopoëtische systeem aantast, effectief te corrigeren. De introductie van vreemde genen in ESC's maakt de snelle creatie van lijnen van homozygote transgene proefdieren mogelijk. Opgemerkt dient echter te worden dat de techniek van gerichte recombinatie-gendeletie tot nu toe alleen betrouwbaar is ontwikkeld met betrekking tot ESC's van muizen. Met behulp van ESC's van muizen met dubbele knock-out werd de functionele rol van de genclusterregio op chromosoom 7 (een kopie van de genomische regio op humaan chromosoom 19) en de proximale regio van chromosoom 11 (een kopie van humaan chromosoom 5g) vastgesteld - deletie van deze genen in ESC's van muizen maakte het mogelijk om de functie van hun analogen bij mensen te evalueren.

De mogelijkheden om de functie van genen voor menselijke embryogenese te bestuderen zijn uitgebreid. Transfectie hiervan in het genoom van ESG's van proefdieren heeft het met name mogelijk gemaakt om de rol van het cryptogen in de vorming en ontwikkeling van het cardiogene mesoderm, het pax-6-gen, in de oogembryogenese te verduidelijken. De eerste kaarten van genexpressie in onrijpe prolifererende ESG's van teratocarcinoom en blastocysten bij muizen worden samengesteld, en suppressieve repressie van transsignalerende genen in ESG's is bevestigd. Een combinatie van 60-80 mutante ESG's en 20-30 cellen van normale pre-implantatie muizenembryo's leidt tot de ontwikkeling van chimere embryo's waarin de orgaanprimordia bestaan uit donor- en ontvangercellen, wat het mogelijk maakt om de rol van onbekende genen in gastrulatie en organogenese te verduidelijken. De functionele kaart van genen van zich ontwikkelende muizenembryo's werd aangevuld met informatie over de rol van het sf-1-gen bij de vorming van de bijnier en de geslachtsklieren, het wt-1-gen bij de vorming van de nier, genen van de myoD-familie bij de vorming van skeletspieren en genen van de gata-1-4-familie bij de restrictierijping van de erytropoëse- en lymfopoëse-rudimenten.

Gerichte uitschakeling van maternale en paternale allelen van genen in ES-cellen met behulp van vectorrecombinases maakte het mogelijk om de functies van verschillende genen in de vroege periode van de embryogenese te verduidelijken, en de technologie van gerichte overdracht van onbekende menselijke genen naar muizen-ES-cellen draagt bij aan de ontdekking van nieuwe mutante genen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van ernstige erfelijke aandoeningen. Met behulp van de knock-outmethode werd de verplichte betekenis van enkele genen voor de vorming van embryonale weefsels bepaald: gata-4 - voor het myocard, gata-1 - voor de erytroïde lijn van hematopoëtisch weefsel, myoD - voor skeletspieren, brachyury - voor het mesoderm, restrictietranscriptases hnf3 en hnf4 - voor leverstamcellen, rag-2 - voor de vorming van T- en B-lymfocytklonen (Repin, 2001). Dubbele deletie van genen in ESC's heeft toegang gegeven tot onderzoek naar de functionele rol van genen in de kiemlaag, segmentatie en homeose, en ESC-transplantatie heeft het mogelijk gemaakt om levensvatbare interspecies hybride embryo's te verkrijgen. Met behulp van een verbeterde techniek voor het transplanteren van een enkele donor-ESC in een 8-cellig embryo, is chimerisatie op cellulair niveau van vele organen van het ontvangende embryo bewezen. Opgemerkt dient te worden dat celspruiten van menselijk weefsel zijn aangetroffen in de organen van ontvangende muizen na de introductie van menselijke hematopoëtische stamcellen in de blastocyst. Het is vastgesteld dat pluripotente ESC's circuleren in het bloed van muizenembryo's tijdens de periode van orgaanvorming. Het is mogelijk dat hun biologische functie ligt in de embryonale organisatie van het toekomstige immuunsysteem. Met behulp van ES-modellen zijn adequate modellen van menselijke genetische pathologie gereproduceerd onder laboratoriumomstandigheden: dubbele knock-out van het dystrofinegen modelleert de spierdystrofie van Duchenne bij muizen, en de uitschakeling van het atm-gen (regulatie van de chromatinesignaalkinasesynthese) - ataxia-telangectasie. Bij deze fatale erfelijke ziekte bij kinderen ontwikkelt zich degeneratie van Purkinjecellen in de kleine hersenen als gevolg van defecten in DNA-herstel, wat gepaard gaat met involutie van de thymus door het afsterven van prolifererende cellen. Het klinische beeld, de pathofysiologie en de pathomorfologie van ataxia-telangectasie, gereproduceerd door pathologische genetische informatie in ES-modellen te introduceren, komen bij chimeramuizen overeen met die bij mensen. Naast ataxia-telangectasia zijn met behulp van ES-cellen en knock-outmuizen experimentele modellen ontwikkeld van enkele erfelijke homozygote menselijke ziekten die verband houden met pathologie van het koolhydraat- en lipidenmetabolisme, aminozuurkatabolisme en uitscheiding van koper en bilirubine. Hierdoor zijn de mogelijkheden van de experimentele geneeskunde op het gebied van preklinische testen van nieuwe behandelmethoden voor de overeenkomstige menselijke ziekten aanzienlijk uitgebreid.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Gebruik van stamcelcytohybriden

Hybride cellen verkregen door fusie van ES-cellen met somatische cellen vormen een adequaat en veelbelovend model voor het bestuderen van de pluripotentie van stamcellen en het herprogrammeren van de chromosomen van gedifferentieerde cellen. Cytohybriden verkregen door fusie van ES-cellen met gedifferentieerde cellen van een volwassen dier maken het mogelijk om de relaties tussen genomen van verschillende "leeftijden" te bestuderen: een unieke situatie ontstaat wanneer homologe chromosomen afkomstig van cellen in verschillende stadia van differentiatie en verschillende maturiteitsniveaus zich in dezelfde celkern bevinden, waar ze gemakkelijk transacterende regulerende signalen kunnen uitwisselen. Het is moeilijk te voorspellen hoe de cisregulerende epigenetische systemen van homologe chromosomen, gevormd tijdens de individuele ontwikkeling, zullen reageren op de invloed van transacterende signalen afkomstig van embryonaal gerelateerde genomen. Bovendien vindt er in hybride cellen segregatie van ouderlijke chromosomen plaats, waardoor we de interactie van genomen op het niveau van individuele chromosomen kunnen bestuderen. Met andere woorden, we kunnen mogelijk de deelname van specifieke chromosomen aan het behoud van pluripotentie identificeren of, omgekeerd, de uitgang naar differentiatie.

Cytohybriden verkregen door de fusie van pluripotente teratocarcinoomcellen en gedifferentieerde somatische cellen werden gebruikt als het eerste experimentele model voor het bestuderen van de interactie van genomen met verschillende "ontwikkelingsgeschiedenissen". In sommige gevallen behielden dergelijke hybride cellen hun pluripotente eigenschappen op een vrij hoog niveau. Met name in vivo teratocarcinoom-somatische hybride cellen induceerden de ontwikkeling van echte teratomen die derivaten van alle drie de kiembladen bevatten, en in vitro in suspensieculturen vormden ze embryonale lichamen. Zelfs bij interspecifieke cytohybriden van dit type werd de aanwezigheid van embryonale antigenen opgemerkt in gevallen waarin de somatische partners in de fusie met teratocarcinoomcellen lymfocyten of thymocyten waren. Het is opmerkelijk dat cytohybriden, gecreëerd door de fusie van teratocarcinoomcellen met fibroblasten, qua fenotype overeenkwamen met fibroblasten.

Het belangrijkste vastgestelde feit is dat in teratocarcinoom-somatische hybride cellen tekenen van herprogrammering van het gedifferentieerde celgenoom optraden, gekenmerkt door reactivatie van individuele genen of het inactieve X-chromosoom van de somatische partner. De resultaten van studies met cytohybriden van het teratocarcinoom-somatische celtype wijzen er dan ook op dat pluripotentie vaak behouden blijft in hybride cellen en dat er tekenen zijn van herprogrammering van het somatische partnergenoom.

In experimenten met het verkrijgen van intraspecifieke embryonale hybride cellen door het fuseren van muizen-ESC's met volwassen splenocyten, werden de kenmerken van dergelijke cytohybriden bestudeerd, werd de segregatie van ouderlijke chromosomen geanalyseerd en werd de pluripotentie van het hybride genoom beoordeeld. Intraspecifieke hybride cellen verkregen door het fuseren van teratocarcinoomcellen met somatische cellen worden gewoonlijk gekenmerkt door een lage chromosoomsegregatie met een tetraploïd of bijna-tetraploïd karyotype. Een vergelijkbare chromosomale samenstelling werd waargenomen in cytohybriden tijdens de fusie van primaire kiemcellen met lymfocyten. Tegelijkertijd vertoonden interspecifieke hybride cellen, verkregen door het fuseren van muizen-teratocarcinoomcellen met nertslymfocyten, een intense segregatie van de chromosomen van de somatische partner.

Een kwalitatief nieuwe fase in het onderzoek naar de segregatie van ouderlijke chromosomen in intraspecifieke hybriden begon met de ontwikkeling van een methode voor het analyseren van microsatellieten met behulp van de polymerasekettingreactie. Dankzij deze methode werden voor elk muizenchromosoom enkele honderden merkers gevonden, waardoor betrouwbaar onderscheid kan worden gemaakt tussen elk paar homologe chromosomen in hybride cellen.

Door ESC's (HM-1-cellen met een deficiëntie in hypoxanthinefosforibosyltransferase-activiteit, 2n = 40, XY, geïsoleerd uit blastocysten van 129/01a-muizen) te fuseren met splenocyten van de congene DD/c-muizen, was het mogelijk een set hybride klonen te verkrijgen die morfologisch vergelijkbaar waren met ESC's. Alle klonen werden geïsoleerd op een selectief medium waarin alleen cellen met actieve hypoxanthinefosforibosyltransferase kunnen groeien. Elektroforetische analyse toonde aan dat alle klonen een allelische variant van hypoxanthinefosforibosyltransferase hadden, kenmerkend voor DD/c-muizen. Cytogenetische analyse toonde aan dat drie van de vier hybride klonen een bijna-diploïde chromosomenset hadden. Eén bijna-tetraploïde kloon bevatte twee populaties hybride cellen, waarvan er één tetraploïde was en de tweede, kleinere, diploïde.

Microsatellietanalyse, waarmee elk paar homologe chromosomen van muizen 129/01a en DD/c kan worden onderscheiden in hybride klonen met een bijna diploïde set, toonde aan dat er in twee klonen een duidelijke preferentiële eliminatie was van autosomen van de somatische partner. De meeste autosomen in de klonen HESS2 en HESS3 hadden markers van de 129/01a-lijn, d.w.z. de pluripotente partner. Uitzonderingen waren chromosoom 1 en I: in de klonen HESS2 en HESS3 waren, naast markers van HM-1-cellen, markers van de somatische partner in kleine hoeveelheden aanwezig. Dergelijke resultaten kunnen wijzen op een onvolledige segregatie van chromosoom 1 en I van de somatische partner en komen overeen met cytogenetische gegevens waaruit blijkt dat trisomie voor deze chromosomen wordt waargenomen in 30-40% van de cellen van de klonen HESS2 en HESS3. Kloon HESS4 verschilde significant in zijn chromosomale samenstelling: veel autosomen in deze kloon waren afkomstig uit het ESC-genoom (chromosomen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 en 17), maar de chromosomen 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 en 19 werden vertegenwoordigd door homologen van beide ouders. De kwantitatieve verhouding van microsatellieten die deze homologe chromosomen markeerden, was ongeveer 1:1. Dit stelde de auteurs in staat om aan te nemen dat één homoloog afkomstig was uit het ESC-genoom en de andere uit gedifferentieerde cellen. In sommige subklonen van kloon HESS4 waren alleen merkers van chromosomen 18 en 19 van de somatische partner aanwezig. De verkregen resultaten geven aan dat in de cellen van de HESS4-kloon, naast de segregatie van de chromosomen van de somatische partner, de eliminatie van een of beide homologen van de hierboven genoemde chromosomen van het pluripotente genoom optrad, dat wil zeggen dat er een bilaterale segregatie van de chromosomen van beide ouders plaatsvond - een zeer ongebruikelijk fenomeen, aangezien segregatie van de chromosomen van slechts één van de ouders kenmerkend is voor cytohybriden.

Bovendien bevatten alle klonen van hybride cellen na de 20e passage alleen nog merkers van het X-chromosoom van de somatische partner; het X-chromosoom van de ESC werd in de klonen vervangen door het X-chromosoom van de somatische partner. Dit belangrijke feit wordt bevestigd door in-situhybridisatiegegevens met een FITC-gelabelde probe specifiek voor het X-chromosoom van de muis: er werd slechts op één chromosoom een positief signaal gedetecteerd. Opgemerkt moet worden dat in eerdere kweekstadia (vóór de 15e passage), volgens cytogenetische gegevens, veel cellen twee X-chromosomen bevatten. Het gebruik van selectieve media maakt het daarom mogelijk om de chromosomale samenstelling van hybride cellen te manipuleren en selectief klonen te selecteren die enkele chromosomen van de somatische partner dragen tegen de achtergrond van het ESC-genoom.

Aangezien een uniek kenmerk van het cytohybride genoom de lokalisatie van het ouderlijk genoom in één celkern is, rijst natuurlijk de vraag naar het behoud van de pluripotente eigenschappen van het embryonale genoom in ESC-somatische celhybriden onder omstandigheden van nauw contact met het genoom van een gedifferentieerde cel. Morfologisch gezien waren de cytohybriden van ESC's en somatische cellen vergelijkbaar met de ouderlijke ESC-lijn. Evaluatie van de pluripotentie toonde aan dat alle klonen met een bijna diploïde chromosomenset in staat waren embryonale lichamen te vormen in suspensieculturen, waarin derivaten van drie kiembladen aanwezig waren.

De meeste hybride cellen bevatten het ECMA-7-antigeen, een marker die kenmerkend is voor vroege muizenembryo's, en vertoonden tevens een hoge alkalische fosfataseactiviteit. De meest overtuigende gegevens over de hoge pluripotente eigenschappen van hybride cellen werden verkregen uit experimenten met een reeks injectiechimeren met hybride cellen van de HESS2-kloon. Analyse van biochemische markers toonde aan dat de afstammelingen van de donorhybridecellen aanwezig waren in de meeste weefsels van de chimeren. Hybride cellen, verkregen door fusie van ES-cellen en somatisch gedifferentieerde cellen, behouden daarom een hoge pluripotentie, inclusief het vermogen om chimeren te vormen wanneer ze in de blastocystholte worden geïnjecteerd.

Klonen HESS2 en HESS4 verschilden significant in de samenstelling van de ouderlijke chromosomen, maar hadden vergelijkbare pluripotente eigenschappen. Aangenomen kan worden dat pluripotentie in het hybride genoom zich manifesteert als een dominante eigenschap, maar het is mogelijk dat niet alle chromosomen van het embryonale genoom betrokken zijn bij het proces van het handhaven van pluripotentie. Als deze aanname klopt, is te verwachten dat de eliminatie van sommige chromosomen van de pluripotente partner uit het genoom van hybride cellen niet gepaard zal gaan met een verandering in hun pluripotente status. In dit geval zou de analyse van de segregatie van ouderlijke chromosomen in embryonale hybride cellen ons in staat stellen om de identificatie van chromosomen die verantwoordelijk zijn voor de controle van de pluripotentie van embryonale cellen, nauw te benaderen.

O. Serov et al. (2001) vonden geen nakomelingen tussen 50 nakomelingen verkregen door kruising van chimaera's met normale muizen met het 129/01a-muisgenotype en het X-chromosoom van DD-muizen. De auteurs zijn van mening dat dit te wijten is aan een afname van de pluripotentie in hybride cellen onder invloed van het somatisch genoom. Een alternatieve verklaring kan het negatieve effect van trisomie op sommige autosomen en een onevenwicht in geslachtschromosomen (XXY werd waargenomen in cellen tot en met de 15e passage) in hybride cellen tijdens de meiose zijn. Het is bekend dat XXY-cellen geen meiose kunnen ondergaan en gameten kunnen vormen. Trisomie kan ook een afname van de proliferatieve activiteit van hybride cellen veroorzaken, waardoor het selectievoordeel bij de ontwikkeling van chimaera's mogelijk toebehoort aan de cellen van het ontvangende embryo. Hieruit volgt dat het voor een adequate beoordeling van het pluripotente potentieel van hybride cellen noodzakelijk is om hybride klonen te verkrijgen met een normale diploïde set chromosomen.

In de experimenten van O. Serov en co-auteurs (2001) werd voor het eerst de mogelijkheid aangetoond om het X-chromosoom van een somatische cel te herprogrammeren in het genoom van hybride cellen. Deze conclusie van de auteurs volgt uit de analyse van de expressie van het hprt-gen (een X-chromosoommarker) in chimere cellen: de aanwezigheid van de allelische variant van hprt van DD/c-muizen werd gedetecteerd in alle geanalyseerde chimere weefsels. Het is gepast om te benadrukken dat na de introductie van hybride cellen in de blastocystholte de cytohybriden in niet-selectieve omstandigheden terechtkomen en het behoud van het X-chromosoom in het genoom van hybride cellen betekent dat het zijn obligate component is geworden en het genoom het niet onderscheidt van het Y-chromosoom van de pluripotente partner.

Samenvattend de auteurs de resultaten van de analyse van de interactie tussen het somatische en pluripotente genoom in hybride embryonale cellen, concluderen ze dat pluripotentie zich in sommige cytohybriden manifesteert als een dominante eigenschap. Het hybride genoom is in staat individuele chromosomen van gedifferentieerde cellen te herprogrammeren, wat echter de mogelijkheid van een omgekeerd effect van het somatische genoom op de pluripotentie van het embryonale genoom niet uitsluit. Bij het kweken van hybride cellen treedt inductie van differentiatie significant vaker op dan in de oorspronkelijke ouderlijke lijn van ES-cellen HM-1. Een soortgelijk effect wordt waargenomen tijdens de vorming van primaire kolonies: veel primaire kolonies van embryonale hybride cellen differentiëren in de vroege stadia van de vorming met grote verliezen aan klonen tijdens hun selectie en reproductie.

Zo behouden cytohybriden, gecreëerd door de fusie van ES-cellen met somatische cellen, ondanks nauw contact met het genoom van gedifferentieerde cellen, pluripotentie als een unieke eigenschap van het embryonale genoom. Bovendien is in dergelijke hybride cellen herprogrammering van individuele chromosomen afkomstig van gedifferentieerde cellen mogelijk. Het blijft onduidelijk in hoeverre de pluripotente eigenschappen van het embryonale genoom behouden blijven in hybride cellen, met name hun vermogen om deel te nemen aan de vorming van de kiemlijn in chimeren. Dit vereist het verkrijgen van embryonale hybride cellen met een normaal karyotype. In ieder geval kunnen pluripotente embryonale hybride cellen een echt genetisch model worden voor de identificatie van chromosomen die betrokken zijn bij het handhaven of beheersen van pluripotentie, aangezien bilaterale segregatie van ouderlijke chromosomen mogelijk een dergelijke mogelijkheid biedt.

Niet minder aantrekkelijk is de studie van het fenomeen dat O. Serov et al. (2001) definiëren als "chromosomaal geheugen". In het hybride genoom bevinden homologe chromosomen zich in twee alternatieve configuraties: homologen van de somatische partner hebben ooit een differentiatie ondergaan, terwijl dit proces bij homologen van de pluripotente partner nog maar net is begonnen. Het behoud van hoog-pluripotente eigenschappen door hybride cellen wijst er dan ook op dat de "pluripotente" configuratie van ESC-homologen voldoende stabiel is in het hybride genoom, ondanks de invloed van transacterende factoren afkomstig van de somatische partner. De hierboven beschreven tekenen van herprogrammering van homologe chromosomen van het gedifferentieerde genoom tijdens de ontwikkeling van chimeren sluiten niet uit dat ze in de eerste stadia van de vorming en cultivatie van cytohybriden in vitro hun status behouden die ze tijdens de differentiatie in vivo hebben verworven. Volgens recent verkregen gegevens vertonen embryonale hybride cellen, wanneer ze worden overgebracht naar een niet-selectieve omgeving, een intensieve eliminatie van alleen de chromosomen van de somatische partner. Dat wil zeggen dat het genoom van hybride cellen homologen gemakkelijk kan onderscheiden na in vitro-kweek gedurende 10-15 passages. Embryonale hybride cellen vormen daarom een veelbelovend experimenteel model voor het bestuderen van niet alleen een fundamentele eigenschap van het embryonale genoom zoals pluripotentie, maar ook het alternatief ervan: embryonale differentiatie.

Therapeutische werkzaamheid van embryonale stamceltransplantatie

Voordat we de therapeutische werkzaamheid van transplantatie van ESC's en hun derivaten analyseren, vatten we bovenstaand materiaal samen. De mogelijkheden van ESC's om embryogenese in vitro volledig te implementeren zijn onvoldoende, aangezien ontwikkelingsdefecten in dit geval te wijten zijn aan de afwezigheid van mesenchymale stamcellen, die autonoom en onafhankelijk van ESC's in het lichaam ontstaan. Het genetische potentieel van ESC's is lager dan dat van de zygote, daarom worden ESC's niet direct gebruikt voor het klonen van embryo's. Het unieke biologische potentieel van ESC's, als de enige cellen waarin ontwikkelingsprogramma's volledig worden ingezet in een consistente implementatie, wordt gebruikt in studies naar genfunctie. Met behulp van ESC's worden de eerste combinaties van signalen die de expressie activeren van vroege en late genen die coderen voor de ontwikkeling van drie kiembladen, gedecodeerd. Het behoud van de pluripotentie van het ESC-genoom in vitro maakt ze een uniek instrument voor herstellende regeneratie, in staat om automatisch cellulaire verliezen aan te vullen in geval van schade aan organen en weefsels. In een ideaal hypothetisch scenario kan worden aangenomen dat “... bij het transplanteren van donor-ESC's compact verpakte programma's worden overgebracht naar het lichaam van de ontvanger, die, onder gunstige omstandigheden, worden gerealiseerd in de constructie van nieuw weefsel'7, dat in staat is om “... effectief te worden geïntegreerd in het lichaam van de ontvanger, zowel op morfologisch als functioneel niveau.”

Na de ontwikkeling van methoden voor monodifferentiatie van ESC's begon uiteraard ook de in-vivostudie van de functionele activiteit van cellen die in vitro werden verkregen uit één gespecialiseerde kloon. Een prolifererende ESC-kloon genereert populaties migrerende voorlopercellen die daadwerkelijk in staat zijn om actief te integreren in gebieden met beschadigde weefsels van de ontvanger, wat wordt gebruikt in de regeneratief-plastische geneeskunde. Het is vastgesteld dat transplantatie van DOPA-neuronen in de substantia nigra de klinische manifestaties bij experimenteel hemiparkinsonisme vermindert. Regionale transplantaties van donorneurale stamcellen verminderen de mate van motorische stoornissen veroorzaakt door trauma of kneuzing van het ruggenmerg en de hersenen. De eerste positieve resultaten van stamceltransplantatie bij demyeliniserende ziekten zijn ook behaald. Het lijkt erop dat het regeneratief-plastische potentieel van ESC's onbegrensde mogelijkheden biedt voor het gebruik van celtransplantatie in de praktische geneeskunde. Wanneer ESC's echter in ectopische zones worden getransplanteerd, transformeren ze onvermijdelijk in tumoren. Teratomen worden gevormd wanneer ESC's subcutaan worden geïnjecteerd in immunodeficiënte muizen. Wanneer ESC-suspensies onder de zaadbalcapsule worden getransplanteerd bij syngene muizen, worden ook teratomen gevormd, bestaande uit verschillende weefsels waarvan de cellen afgeleid zijn van alle drie de kiembladen. Bij dergelijke teratomen zijn processen van verminderde organogenese uiterst zeldzaam.

Een aantal studies geeft informatie over de positieve resultaten van het transplanteren van vroege ESC-derivaten naar dieren met experimentele pathologie. Cellulaire neurotransplantatie met ESC-derivaten wordt verder ontwikkeld in experimenten en de eerste klinische studies om functionele stoornissen bij hersen- en ruggenmergletsel te corrigeren en syringomyelie en multiple sclerose te behandelen (Repin, 2001). Met de komst van de techniek van in-vitro-neurogenese uit ESC's worden, in plaats van embryonaal hersenweefsel, methoden ontwikkeld voor het transplanteren van neurosfeerderivaten verkregen uit embryonale zenuwweefselculturen. Dergelijke transplantaatsuspensies zijn aanzienlijk homogener en bevatten toegewijde voorlopercellen van neuronen en neuroglia.

Door regelmatige toevoeging van retinoïnezuur in een dosis van 10 μg/ml aan het kweekmedium gedurende 6 weken, wordt meer dan 80% van de postmitotische neuronen gevormd in de humane embryo-(terato)-carcinoomlijn NTERA-2. Volledige homogeniteit van de neuronale populatie wordt bereikt door flow sorting van volwassen neuronen, gelabeld met immunofenotypische markers, waardoor resten van teratocarcinoom en onvolwassen cellen kunnen worden verwijderd. Na transplantatie in verschillende hersengebieden bij proefdieren overleven deze neuronen niet alleen, maar integreren ze ook in regionale neurale netwerken. Bij proefdieren met experimentele modellen van lokale CZS-defecten vermindert neurotransplantatie de klinische manifestaties van humane pathologieën zoals de gevolgen van traumatisch hersenletsel, beroerte, demyeliniserende aandoeningen, erfelijke defecten in de ontwikkeling van de kleine hersenen en aandoeningen veroorzaakt door lipiden- en polysaccharideafzetting.

Om regeneratieprocessen bij degeneratieve aandoeningen van het centrale zenuwstelsel te optimaliseren, worden technologieën ontwikkeld om myelineproducerende oligodendrocyten uit ES-cellen te verkrijgen. De eerste fase omvat traditioneel de proliferatie van ES-cellen met de reproductie van het aantal cellen dat nodig is voor transplantatie. In de tweede fase vindt gerichte differentiatie van cellen tot een populatie van myelineproducerende oligodendrocytprecursoren plaats, die wordt aangestuurd door selectieve markerantigenen.

Er openen zich bepaalde perspectieven voor het gebruik van ESC-derivaten voor de ontwikkeling van methoden voor het corrigeren van immunodeficiënties veroorzaakt door genetische defecten in de thymusrijping. In studies met knockout (rag 1) muizen met een geïnduceerd gendefect – een verstoring van het recombinatiemechanisme van V(D)J-loci van TCR-genen, wat leidt tot verlies van T-lymfocytfunctie – herstelt transplantatie van vroege ESC-derivaten in de thymus van dieren de rijping van normale populaties immuunklonen die verantwoordelijk zijn voor cellulaire immuniteit. Klinische studies naar de transplantatie van in vitro gepreformeerde ESC's voor de behandeling van fatale erfelijke anemieën bij kinderen zijn gaande.

Bezwaren tegen de snelle introductie van stamceltransplantatie in de kliniek zijn gebaseerd op het beperkte aantal stabiele lijnen van humane embryonale stamcellen en de noodzaak van standaardisatie. Om de zuiverheid van gestandaardiseerde ESC-lijnen, evenals van volwassen humane stamcellen, te verhogen, wordt voorgesteld om een methode van lijnselectie te gebruiken op basis van moleculair genetische analyse van korte tandem DNA-herhalingen. Het is ook noodzakelijk om ESC-lijnen te testen op de aanwezigheid van kleine chromosomale herschikkingen en genetische mutaties, waarvan de kans op het optreden onder celkweekomstandigheden vrij groot is. Er wordt een proefschrift gepresenteerd over het verplicht testen van de eigenschappen van alle soorten ESC's en regionale pluripotente stamcellen, aangezien hun reproductie in vitro kan leiden tot het ontstaan van nieuwe eigenschappen die niet inherent zijn aan embryonale stamcellen of definitieve weefsels. In het bijzonder wordt aangenomen dat langdurige kweek in media met cytokines ESC-lijnen dichter bij tumorcellen brengt, omdat ze vergelijkbare veranderingen ondergaan in de regulatie van de celcyclus met de verwerving van het vermogen om een onbeperkt aantal celdelingen uit te voeren. Sommige auteurs beschouwen transplantatie van vroege embryonale stamcelderivaten in mensen als roekeloos, gezien de kans op tumorontwikkeling. Volgens hen is het veel veiliger om toegewijde afstammelingen van ES-cellen te gebruiken, d.w.z. lijnen van gedifferentieerde celvoorlopers. Momenteel is er echter nog geen betrouwbare techniek ontwikkeld om stabiele menselijke cellijnen te verkrijgen die in de gewenste richting differentiëren.

Zo verschijnen er steeds meer gegevens in de literatuur over het positieve therapeutische effect van transplantatie van menselijke embryonale stamcelderivaten. Veel van deze studies worden echter herzien en bekritiseerd. Sommige onderzoekers zijn van mening dat de resultaten van vroege klinische studies voorlopig van aard zijn en slechts aangeven dat stamcellen een gunstig effect kunnen hebben op het klinische beloop van een bepaalde ziekte. Daarom is het noodzakelijk om gegevens te verkrijgen over de resultaten van celtransplantatie op afstand. De ontwikkelingsstadia van de klinische neurotransplantatie worden als argument aangehaald. Aanvankelijk domineerden publicaties over de hoge efficiëntie van transplantatie van embryonale hersenfragmenten bij de ziekte van Parkinson, maar daarna verschenen er rapporten die de therapeutische efficiëntie van embryonaal of foetaal zenuwweefsel dat in de hersenen van patiënten werd getransplanteerd, ontkenden.

De eerste klinische studies werden uitgevoerd om de veiligheid te beoordelen van transplantatie van neuroblasten afkomstig van NTERA-2 teratocarcinoom-ESC's, waarvan onrijpe cellen in kweek werden geprolifereerd tot een accumulatie van 100 miljoen cellen. Een deel van de op deze manier verkregen cellen werd gebruikt om het fenotype te karakteriseren en cellulaire onzuiverheden te bepalen, en om te testen op mogelijke besmetting met virussen en bacteriën. LIF en de feederlaag van foetale stromacellen werden uit het kweekmedium verwijderd en er werden omstandigheden gecreëerd voor gerichte differentiatie van ESC's tot neuroblasten met behulp van een combinatie van cytokines en groeifactoren. Vervolgens werden de neuroblasten gezuiverd van onrijpe teratocarcinoomcellen met behulp van een flow cell sorter. Na secundaire zuivering en fenotypering van de getransplanteerde cellen werd een suspensie van neuroblasten (10-12 miljoen) geïnjecteerd in de basale nucleus van de hersenen van de patiënten (in de zevende maand na de hersenbloeding) met behulp van een speciale microcanule en spuit, onder stereotactische en CT-controle. Na-transplantatie screening gedurende één jaar naar de gevolgen van neurontransplantatie in het beroertegebied leverde geen bijwerkingen of ongewenste effecten op. De helft van de patiënten vertoonde verbetering van de motorische functie in de periode van 6 tot 12 maanden na de transplantatie. Positieve klinische veranderingen gingen gepaard met een verhoogde bloedtoevoer naar het beroertegebied na celtransplantatie: de gemiddelde toename in de absorptie van fluorescent gelabeld 2-deoxyglucose, volgens positronemissietomografie, bereikte 18% en bij sommige patiënten zelfs 35%.

De Amerikaanse National Institutes of Health voerden echter een onafhankelijke studie uit naar de klinische effectiviteit van neurotransplantatie bij patiënten met parkinsonisme. Patiënten in de eerste groep kregen een transplantatie met stukjes embryonaal zenuwweefsel die dopamine produceren, terwijl de tweede groep patiënten een schijnoperatie onderging. De resultaten wijzen op nul klinische effectiviteit van een dergelijke neurotransplantatie, ondanks het feit dat dopamineproducerende embryonale neuronen in de hersenen van de ontvangers overleefden. Bovendien ontwikkelde 15% van de patiënten twee jaar na de transplantatie van embryonaal zenuwweefsel aanhoudende dyskinesie, die afwezig was bij patiënten in de placebogroep (Stem cells: scientific progress and future research direction. Nat. Inst. of Health. USA). Observaties naar de verdere ontwikkeling van de ziekte bij deze patiënten zijn gaande.

Sommige auteurs associëren de tegenstrijdige literatuurgegevens over de beoordeling van de klinische effectiviteit van neurotransplantatie met verschillende benaderingen bij de selectie van patiëntengroepen, een ontoereikende keuze van methoden om hun toestand objectief te beoordelen en, het allerbelangrijkst, verschillende periodes van ontwikkeling van embryonaal zenuwweefsel en verschillende gebieden van de hersenen waaruit dit weefsel is verkregen, verschillende transplantaatgroottes en methodologische kenmerken van chirurgische ingrepen.

Opgemerkt dient te worden dat pogingen tot directe transplantatie van pluripotente embryonale stamcellen in het striatum van ratten met experimenteel hemiparkinsonisme gepaard gingen met proliferatie van ES-cellen en hun differentiatie tot dopaminerge neuronen. Aangenomen moet worden dat nieuw gevormde neuronen effectief werden geïntegreerd in neurale netwerken, aangezien na ESC-transplantatie correctie van gedragsafwijkingen en motorische asymmetrie in de apomorfinetest werd waargenomen. Tegelijkertijd stierven sommige dieren als gevolg van de transformatie van getransplanteerde ES-cellen tot hersentumoren.

Deskundigen van de nationale en medische academies van de VS en specialisten van het National Institute of Health in de VS zijn van mening dat het klinische potentieel van ESCS de meeste aandacht verdient, maar benadrukken de noodzaak van een gedetailleerde studie naar hun eigenschappen, de waarschijnlijkheid van complicaties en de gevolgen op de lange termijn in experimenten met adequate biologische modellen van menselijke ziekten (Stamcellen en de toekomstige regeneratieve geneeskunde, National Academy Press.; Stamcellen en de toekomstige onderzoeksrichtingen. Nat. Inst. of Health USA).

Vanuit dit oogpunt is het belangrijk dat een vergelijkende histologische analyse van experimentele teratomen, verkregen door transplantatie van ESC-suspensie in de testis, met teratomen gevormd als gevolg van transplantatie van een vroeg embryo, dat ook ESC bevat, aantoonde dat ESC, ongeacht hun oorsprong of interactie met bepaalde omliggende cellen, hun tumorvormende potentieel op dezelfde manier benutten. Het is bewezen dat dergelijke teratomen een klonale oorsprong hebben, aangezien tumoren bestaande uit derivaten van alle drie de kiembladen kunnen ontstaan uit één ESC (Rega, 2001). Het is opmerkelijk dat wanneer gekloonde ESC's met een normaal karyotype werden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen, er ook teratomen werden gevormd bestaande uit verschillende soorten gedifferentieerde somatische cellen. Deze experimentele gegevens vormen een onomstotelijk bewijs voor de klonale oorsprong van teratomen. Vanuit ontwikkelingsbiologisch oogpunt geven ze aan dat niet meerdere toegewijde voorlopercellen, maar één enkele pluripotente stamcel fungeert als bron van gedifferentieerde derivaten van alle drie de kiembladen waaruit een teratoom bestaat. Op weg naar praktische celtransplantatie zijn de resultaten van deze studies echter, zo niet onoverkomelijk, dan toch een waarschuwing voor potentieel gevaar, aangezien inoculatie van ES-cellen of primordiale kiemcellen in verschillende weefsels van volwassen immuundeficiënte muizen onvermijdelijk leidt tot de ontwikkeling van tumoren uit getransplanteerde stamcellen. Neoplastische degeneratie van ectopisch getransplanteerde ES-cellen gaat gepaard met de opkomst van satellietpopulaties van gedifferentieerde cellen – als gevolg van gedeeltelijke differentiatie van ES-cellen en progenitorklonen tot gespecialiseerde cellijnen. Interessant is dat wanneer ES-cellen in skeletspieren worden getransplanteerd, neuronen meestal naast teratocarcinoomcellen worden gevormd. De introductie van ES-cellen in een delende eicel of blastocyst gaat echter gepaard met volledige integratie van de cellen in het embryo zonder de vorming van neoplastische elementen. In dit geval worden ES-cellen geïntegreerd in vrijwel alle organen en weefsels van het embryo, inclusief het genitale primordium. Dergelijke allofeen-dieren werden voor het eerst verkregen door teratocarcinoom 129-cellen in vroege embryo's in de 8-100-celstadia te introduceren. Bij allofeen-muizen worden populaties heterogene cellen, afkomstig van donor-ESC's, geïntegreerd in de weefsels van het beenmerg, de darm, de huid, de lever en de genitaliën, waardoor het mogelijk is om in het experiment zelfs interspecies-celchimeren te creëren. Hoe korter de ontwikkelingsperiode van het vroege embryo, hoe hoger het percentage celchimerisatie, met de hoogste mate van chimerisatie waargenomen in het hematopoëtische systeem, de huid, het zenuwstelsel, de lever en de dunne darm van het allofeen-embryo. In een volwassen organisme zijn weefsels die door histohematische barrières beschermd zijn tegen het immuunsysteem van de ontvanger, vatbaar voor chimerisatie:Transplantatie van primaire kiemcellen in het testisparenchym gaat gepaard met de incorporatie van donorstamcellen in de kiemweefsellaag van de ontvanger. Bij transplantatie van ES-cellen in een blastocyst vindt echter geen vorming van chimere rudimenten van de geslachtsorganen plaats met de generatie van donor-primaire kiemcellen. De pluripotentie van ES-cellen kan, onder speciale omstandigheden, ook worden gebruikt voor klonering: transplantatie van muizen-ES-cellen in een 8-16-cellig muizenembryo, waarin celmitoses worden geblokkeerd door cytocalsine, bevordert de implementatie van normale embryogenese met de ontwikkeling van een embryo uit donor-ES-cellen.

Een alternatief voor allogene ESC-transplantatie is daarom therapeutisch klonen, gebaseerd op de transplantatie van somatische celkernen in een ontkernde eicel om een blastocyst te creëren. Uit de binnenste celmassa daarvan worden vervolgens lijnen ESC's geïsoleerd die genetisch identiek zijn aan de donor van de somatische kern. Technisch gezien is dit idee zeer haalbaar, aangezien de mogelijkheid om ESC-lijnen te creëren uit blastocysten verkregen na transplantatie van somatische kernen in ontkernde eicellen herhaaldelijk is aangetoond in experimenten met proefdieren (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Met name bij muizen die homozygoot zijn voor de rag2-genmutatie, werden fibroblasten, verkregen door het kweken van subepidermale weefselcellen, gebruikt als donoren van kernen, die vervolgens werden getransplanteerd in ontkernde eicellen. Na de activering van de eicel werd de "zygote" gekweekt tot blastocystvorming. Uit de binnenste celmassa waarvan ESC's werden geïsoleerd en overgebracht naar een cellijn die nullizygoot was voor het mutante gen (rag2~/~). De mutatie van één allelisch gen werd in dergelijke ESC's gecorrigeerd met behulp van homologe recombinatie. In de eerste reeks experimenten werden embryonale lichamen verkregen uit ESC's met een recombinant hersteld gen. De cellen ervan werden getransfecteerd met een recombinant retrovirus (HoxB4i/GFP) en na reproductie geïnjecteerd in de ader van rag2~/~ muizen. In de tweede reeks werden tetraploïde blastomeren geaggregeerd met genetisch gemodificeerde ESC's en getransplanteerd in ontvangende vrouwtjes. De resulterende immunocompetente muizen dienden als beenmergdonoren voor transplantatie in rag2~/~ mutante muizen. In beide reeksen was het resultaat positief: na 3-4 weken werden in alle muizen volwassen normale myeloïde en lymfoïde cellen gevonden die in staat waren immunoglobulinen te produceren. Transplantatie van somatische celkernen in oöcyten kan dus niet alleen worden gebruikt om ESC-lijnen te verkrijgen, maar ook voor cytogenotherapie – correctie van erfelijke afwijkingen, waarbij ESC wordt gebruikt als vector voor het transport van corrigerende genetische informatie. Maar deze richting van celtransplantatie kent, naast bio-ethische problemen, ook beperkingen. Het is onduidelijk hoe veilig de transplantatie van therapeutisch gekloonde cellen met een genotype dat identiek is aan dat van een specifieke patiënt zal zijn, aangezien dergelijke cellen mutaties kunnen introduceren die een predispositie voor andere ziekten creëren. Normale menselijke eicellen blijven een moeilijk toegankelijk object, terwijl zelfs bij transplantatie van somatische celkernen in ontkernde dierlijke eicellen slechts 15-25% van de geconstrueerde "zygoten" zich ontwikkelt tot het blastocyststadium. Het is nog niet vastgesteld hoeveel blastocysten nodig zijn om één lijn pluripotente gekloonde ESC's te verkrijgen. Het is ook vermeldenswaard de hoge financiële kosten die gepaard gaan met de complexiteit van de therapeutische kloonmethodologie.

Concluderend moet worden opgemerkt dat bij ESC's de pluripotentie van het genoom met hypogemethyleerd DNA wordt gecombineerd met een hoge telomeraseactiviteit en een korte C^-fase van de celcyclus, wat zorgt voor hun intensieve en potentieel oneindige reproductie, waarin ESC's een diploïde set chromosomen en een "juveniele" set fenotypische kenmerken behouden. De klonale groei van ESC's in kweek interfereert niet met hun differentiatie tot een gespecialiseerde cellijn van het organisme wanneer de proliferatie wordt gestopt en passende regulerende signalen worden toegevoegd. Restrictiedifferentiatie van ESC's tot somatische cellijnen in vitro wordt gerealiseerd zonder de deelname van het mesenchym, waarbij de Nochteys worden omzeild, buiten de organogenese en zonder embryovorming. Ectopische introductie van ESC's in vivo leidt onvermijdelijk tot de vorming van teratocarcinomen. Transplantatie van ESC's in een blastocyst of vroeg embryo gaat gepaard met hun integratie met de embryonale weefsels en stabiele chimerisatie van de organen.

Regeneratieve plastische technologieën gebaseerd op celtransplantatie vormen het snijpunt van interesses van vertegenwoordigers van de celbiologie, ontwikkelingsbiologie, experimentele genetica, immunologie, neurologie, cardiologie, hematologie en vele andere takken van experimentele en praktische geneeskunde. De belangrijkste resultaten van experimentele studies bewijzen de mogelijkheid om stamcellen te herprogrammeren met een gerichte verandering in hun eigenschappen, wat perspectieven opent voor het beheersen van cytodifferentiatieprocessen met behulp van groeifactoren – voor myocardregeneratie, herstel van CZS-laesies en normalisatie van de functie van het eilandjesapparaat van de pancreas. Voor de brede introductie van transplantatie van ESC-derivaten in de praktische geneeskunde is het echter noodzakelijk om de eigenschappen van humane stamcellen nader te bestuderen en experimenten met ESC's op experimentele ziektemodellen voort te zetten.

Bio-ethische kwesties en het probleem van afstoting van een allogene celtransplantatie zouden kunnen worden opgelost door de ontdekte plasticiteit van het genoom van regionale stamcellen van een volwassen organisme. De aanvankelijke informatie, namelijk dat bij transplantatie van geïsoleerde en zorgvuldig gekarakteriseerde hematopoëtische autologe cellen in de lever, waaruit nieuwe hepatocyten ontstaan en die integreren in de leverlobjes, wordt nu herzien en bekritiseerd. Desondanks zijn er gegevens gepubliceerd die aantonen dat transplantatie van neurale stamcellen in de thymus de vorming van nieuwe donor-T- en B-lymfocytenscheuten veroorzaakt, en transplantatie van neurale stamcellen uit de hersenen in het beenmerg leidt tot de vorming van hematopoëtische scheuten met langdurige donormyelo- en erytropoëse. Bijgevolg kunnen pluripotente stamcellen die in staat zijn het genoom te herprogrammeren voor het potentieel van ES-cellen, in de organen van een volwassen organisme blijven bestaan.

De bron voor het verkrijgen van ESC voor medische doeleinden blijft het menselijk embryo, dat de onvermijdelijkheid van een nieuw kruispunt van morele, ethische, juridische en religieuze kwesties aan het begin van het menselijk leven bepaalt. De ontdekking van ESC heeft een krachtige impuls gegeven aan de hervatting van moeilijke discussies over waar de grens ligt tussen levende cellen en materie, zijn en persoonlijkheid. Tegelijkertijd bestaan er geen universele normen, regels en wetten met betrekking tot het gebruik van ESC in de geneeskunde, ondanks herhaalde pogingen om deze te creëren en aan te nemen. Elke staat lost dit probleem onafhankelijk op binnen het kader van zijn wetgeving. Artsen van hun kant blijven wereldwijd proberen om regeneratief-plastische geneeskunde buiten het bereik van dergelijke discussies te brengen, voornamelijk door het gebruik van volwassen stamcelreserves in plaats van embryonale stamcellen.

Een beetje geschiedenis van de isolatie van embryonale stamcellen

Terato(embryo)carcinoomcellen werden geïsoleerd uit spontaan optredende testiculaire teratomen van 129/ter-Sv-muizen, spontane ovariumteratomen van Lt/Sv-muizen en uit teratomen afkomstig van ectopisch getransplanteerde embryonale cellen of weefsels. Van de stabiele muizenterato(embryo)carcinoomcellijnen die op deze manier werden verkregen, waren sommige pluripotent, andere differentieerden slechts tot één specifiek celtype en sommige waren volledig onbekwaam tot cytodifferentiatie.

Vroeger lag de nadruk op onderzoeken waarvan de resultaten erop wezen dat het mogelijk was om terato-(embryo)-carcinoomcellen na introductie in de weefsels van een zich ontwikkelend embryo weer tot een normaal fenotype te laten terugkeren, en op onderzoek naar de in vitro-creatie van genetisch gemodificeerde terato-(embryo)-carcinoomcellen, waarmee mutante muizen werden verkregen voor biologische modellering van erfelijke pathologie bij de mens.

Geconditioneerde suspensiekweek werd gebruikt om terato-(embryo)-carcinoomcellijnen te isoleren. In kweek groeien terato-(embryo)-carcinoomcellen, zoals ES-cellen, uit tot embryonale lichamen en vereisen ze verplichte dissociatie voor lijnoverdracht, waarbij hun pluripotentie behouden blijft op een voedingslaag van embryonale fibroblasten of tijdens suspensiekweek in een geconditioneerd medium. Cellen van pluripotente terato-(embryo)-carcinoomlijnen zijn groot, bolvormig, gekenmerkt door een hoge alkalische fosfataseactiviteit, vormen aggregaten en zijn in staat tot multidirectionele differentiatie. Wanneer ze in een blastocyst worden ingebracht, aggregeren ze met de morula, wat leidt tot de vorming van chimere embryo's, in de samenstelling van verschillende organen en weefsels waarvan derivaten van terato-(embryo)-carcinoomcellen worden aangetroffen. De overgrote meerderheid van dergelijke chimere embryo's sterft echter in utero, en in de organen van overlevende pasgeboren chimaera's worden vreemde cellen zelden en in lage dichtheid gedetecteerd. Tegelijkertijd neemt de incidentie van tumoren (fibrosarcoom, rhabdomyosarcoom, andere soorten kwaadaardige tumoren en pancreasadenoom) sterk toe en treedt tumordegeneratie vaak op tijdens de periode van intra-uteriene ontwikkeling van chimere embryo's.

De meeste terato-(embryo)-carcinoomcellen in de micro-omgeving van normale embryonale cellen verkrijgen vrijwel van nature maligne neoplastische kenmerken. Men neemt aan dat onomkeerbare maligniteit te wijten is aan de activering van proto-oncogenen tijdens structurele herschikkingen. Een uitzondering hierop zijn cellen van de embryocarcinoomlijn SST3, verkregen uit muizentesticulaire teratomen (lijn 129/Sv-ter), die een hoog vermogen vertonen om te integreren in de weefsels en organen van het embryo zonder daaropvolgende tumorvorming in chimere muizen. Derivaten van terato-(embryo)-carcinoomcellijnen in chimere muizen nemen praktisch niet deel aan de vorming van primaire gonocyten. Blijkbaar is dit te wijten aan de hoge frequentie van chromosomale afwijkingen die kenmerkend zijn voor de meeste terato-(embryo)-carcinoomlijnen, in de cellen waarvan zowel aneuploïdie als chromosomale afwijkingen worden waargenomen.

Verschillende stabiele lijnen van humane terato-(embryo)-carcinoomcellen, gekenmerkt door pluripotentie, hoge proliferatieve activiteit en het vermogen om te differentiëren tijdens groei in culturen, werden verkregen onder laboratoriumomstandigheden. In het bijzonder werd de lijn van humane terato-(embryo)-carcinoomcellen NTERA-2 gebruikt om de mechanismen van neurale cytodifferentiatie te bestuderen. Na transplantatie van cellen van deze lijn in de subventriculaire regio van de voorhersenen van pasgeboren ratten, werden hun migratie en neurogenese waargenomen. Er werden zelfs pogingen ondernomen om neuronen, verkregen door het kweken van cellen van de terato-(embryo)-carcinoomlijn NTERA-2, te transplanteren naar patiënten met een beroerte, wat volgens de auteurs leidde tot een verbetering van het klinische beloop van de ziekte. Tegelijkertijd waren er geen gevallen van maligniteit van getransplanteerde cellen van de terato-(embryo)-carcinoomlijn NTERA-2 bij patiënten met een beroerte.

De eerste lijnen ongedifferentieerde pluripotente embryonale stamcellen van muizen werden begin jaren 80 verkregen door Evans en Martin, die ze isoleerden uit de binnenste celmassa van de blastocyst – de embryoblast. De geïsoleerde ESC-lijnen behielden lange tijd hun pluripotentie en het vermogen om onder invloed van factoren in een speciaal kweekmedium te differentiëren tot verschillende celtypen.

De term "embryonale pluripotente stamcel" is van Leroy Stevens, die tijdens zijn onderzoek naar het effect van tabaksteer op de incidentie van tumorontwikkeling de aandacht vestigde op het spontane optreden van testiculaire teratocarcinomen bij lineaire (129/v) muizen uit de controlegroep. De cellen van testiculaire teratocarcinomen werden gekenmerkt door een hoge proliferatiesnelheid en differentieerden spontaan in aanwezigheid van vocht uit de buikholte met de vorming van neuronen, keratinocyten, chondrocyten, cardiomyocyten, evenals haar- en botfragmenten, maar zonder tekenen van geordende cytoarchitectuur van het corresponderende weefsel. Wanneer ze in kweek werden geplaatst, groeiden teratocarcinoomcellen als pluripotente klonen los van het substraat en vormden embryonale lichamen, waarna ze stopten met delen en spontaan een ongeordende differentiatie ondergingen tot neuronen, gliacellen, spiercellen en cardiomyocyten. Stevens ontdekte dat muizenteratocarcinoom 129/v minder dan 1% cellen bevat die in staat zijn te differentiëren tot diverse gespecialiseerde somatische lijnen, en dat de differentiatie zelf afhangt van de factoren die deze beïnvloeden (de samenstelling van de peritoneale vloeistof, producten van volwassen cellen of weefsels die aan de kweek worden toegevoegd). De hypothese van Leroy Stevenson over de aanwezigheid van embryonale voorlopercellen van de kiemlijn tussen teratocarcinoomcellen werd bevestigd: een suspensie van embryoblastcellen uit pre-implantatie-embryo's in de weefsels van volwassen muizen vormde teratocarcinomen, en zuivere cellijnen die daaruit werden geïsoleerd na intraperitoneale toediening aan ontvangende dieren, differentieerden tot neuronen, cardiomyocyten en andere somatische cellen afkomstig van alle drie de kiembladen. In in-vivo-experimenten resulteerde transplantatie van ES-cellen (verkregen uit de embryoblast, maar niet uit de trofoblast) in muizenembryo's van een andere lijn in de blastomeerstadia 8-32 in de geboorte van chimere dieren (zonder de ontwikkeling van tumoren), in wier organen spruiten van donorweefsel werden gevonden. Zelfs in de kiemcellijn werd chimerisme waargenomen.

Primaire stamcellen, geïsoleerd uit het genitale rudiment van een muizenembryo, kwamen qua morfologie, immunologisch fenotype en functionele kenmerken overeen met ES-cellen die Stevenson had verkregen uit teratocarcinoom en embryoblast. In chimaera's geboren na introductie van ES-cellen in een blastocyst, werd de allofene morfogenese van organen gekenmerkt door een mozaïekachtige afwisseling van donor- en ontvangerstructurele en functionele eenheden van de lever, longen en nieren. In sommige gevallen werd de vorming van darmcrypten of leverlobuli waargenomen, bestaande uit zowel ontvanger- als donorcellen. De morfogenese verliep echter altijd volgens het genetische programma van de soort waartoe de ontvanger behoorde, en chimerisme beperkte zich uitsluitend tot het cellulaire niveau.

Vervolgens werd vastgesteld dat proliferatie van ESC's zonder cytodifferentiatie op een voedingslaag van mesenchym-afgeleide cellen (foetale fibroblasten) plaatsvindt met de verplichte aanwezigheid van LIF in selectieve voedingsmedia, die selectief de overleving van alleen stam- en progenitorcellen garanderen, terwijl de overgrote meerderheid van de gespecialiseerde cellulaire elementen afsterft. Met behulp van dergelijke methoden isoleerde James Thomson in 1998 vijf geïmmortaliseerde lijnen van embryonale stamcellen uit de binnenste celmassa van een menselijke blastocyst. In hetzelfde jaar ontwikkelde John Gerhart een methode voor het isoleren van onsterfelijke ESC-lijnen uit de genitale tuberkel van vier tot vijf weken oude menselijke embryo's. Vanwege hun unieke eigenschappen begonnen embryonale stamcellen en stamcellen van definitieve weefsels slechts twee jaar later te worden gebruikt in de praktijk van regeneratieve geneeskunde en gentherapie.