Muggen met ingebouwd 'genetisch schild' stoppen malaria - infectiepercentages dalen met 93%

Het overwinnen van resistentie tegen insecticiden: hoe een enkele genmodificatie in muggen zichzelf generaties lang verspreidt en zo de overdracht van malaria vrijwel elimineert zonder de overleving in gevaar te brengen.

In een onlangs gepubliceerd onderzoek in Nature onderzocht een team van wetenschappers of het glutamine 224 (Q224)-allel in fibrinogeen-gerelateerd proteïne 1 (FREP1) Anopheles stephensi-muggen resistent maakt tegen infectie met Plasmodium. Daarnaast schatten ze de overlevingskosten die met dit allel gepaard gaan en testten ze een allelisch gen-drivesysteem om deze beschermende mutatie door populaties te verspreiden.

Vereisten

In 2023 stierven ongeveer 600.000 mensen aan malaria, voornamelijk kinderen in Sub-Sahara Afrika en Zuid-Azië. Traditionele bestrijdingsmethoden – klamboes, insecticiden, malariamedicijnen – verliezen hun effectiviteit door resistentie bij muggen en parasieten. Gene drive-technologieën die gunstige allelen verspreiden via muggenpopulaties bieden een veelbelovende en duurzame oplossing.

Het FREP1-eiwit helpt parasieten de middendarm van de mug te passeren, maar de natuurlijke variant Q224 kan infectie voorkomen zonder de biologie van de mug in gevaar te brengen. Het doel was om te testen of zo'n endogeen allel veilig verspreid kon worden om malariaoverdracht te verminderen en tegelijkertijd de levensvatbaarheid van de mug te behouden.

Over de studie

Met behulp van CRISPR/Cas9 werden twee stammen van Anopheles stephensi gecreëerd die alleen verschilden in het 224e aminozuur in het FREP1-eiwit: een wildtype met leucine (L224) en een potentieel beschermende stam met glutamine (Q224). De guide-RNA richtte zich op een intronregio 126 bp stroomopwaarts van het codon, wat homologe recombinatie mogelijk maakte met de insertie van een fluorescerend label (GFP of RFP).

De fitheid werd beoordeeld aan de hand van vleugellengte, vruchtbaarheid, uitkomst van de eieren, verpopping, opkomst van volwassen dieren en levensduur (Kaplan-Meier overlevingsanalyse).

De vectorcompetentie werd bepaald met behulp van standaard membraanvoeding met parasieten zoals Plasmodium falciparum (mens) en Plasmodium berghei (knaagdier), met tellingen van oöcysten en sporozoïeten in de speekselklieren.

Het allel-drivesysteem omvatte een cassette met gRNA tegen L224 en Cas9, onder controle van de vasa-promotor. De allelfrequenties werden gemonitord met behulp van fluorescerende tags in experimenten met meerdere cycli (10 generaties). Genotypering werd uitgevoerd met behulp van PCR, Sanger-sequencing en NGS. Bayesiaanse modellering schatte de allelconversie, fitnesskosten en dynamiek tijdens vrije paring in het laboratorium.

Resultaten

Het FREP1Q224-allel veroorzaakte geen significante afname in overleving: vleugellengte, vruchtbaarheid, uitkomst, verpopping en het uitkomen van de volwassen dieren waren identiek aan die van de FREP1L224-controle. Kleine verschillen in mannelijke grootte en levensduur hadden geen invloed op de concurrentiekracht. Maagdelijke FREP1Q224-vrouwtjes leefden even lang als controles, en vrouwtjes vertoonden na bloedvoeding slechts een lichte afname in levensduur.

Uitdagingsexperimenten lieten een duidelijke bescherming zien bij homozygoten.

• Bij lage concentraties van P. falciparum gametocyten (0,08%):
  • Infectiepercentage daalde van 80% naar ~30% in FREP1Q224;
  • Gemiddeld aantal oöcysten: van 3 tot 0;
  • Sporozoïeten in speekselklieren: van >4000 tot 0.
• Bij hogere gametocytemie (0,15%):
  • Gemiddeld aantal oöcysten: van ~32 tot
  • Ook het aantal sporozoïeten nam dramatisch af.
• Voor P. berghei:
  • Gemiddeld aantal oöcysten: van 43 tot 25;
  • Sporozoïeten: van ~19.000 tot 11.000.
• Heterozygoten (FREP1L224/Q224) waren niet beschermd.

Efficiëntie van gen-drives

• Bij gepaarde kruisingen zette Cas9 + gRNA L224 50 tot 86% van de FREP1L224-allelen om in FREP1Q224;
• Bij materneel Cas9 was de frequentie hoger;
• In de 2e generatie bereikte de frequentie van het beschermende allel 93%;
• De incidentie van fouten in het NHEJ-herstelpad was laag (0–12%) en veroorzaakte doorgaans schade.
• In celpopulaties met een donor:ontvanger-ratio van 1:3 nam de FREP1Q224-frequentie toe van 25% tot >90% gedurende 10 generaties;
• De frequentie van NHEJ-allelen daalde van 5,4% naar

Bayesiaanse modellering ondersteunde de hypothese van hoge conversie, lage frequentie van stabiele mutaties en een letaal steriel mozaïcisme-effect, waarbij WT-homozygoten met het maternale Cas9-genotype leden aan somatische mutaties en een verminderde overleving.

Bij latere generaties werd een bijna volledige onderdrukking van P. falciparum-oöcysten waargenomen (mediaan 0 tot 5,5), wat bevestigde dat de populatie grotendeels ongevoelig was geworden voor overdracht van parasieten.

Het beschermende allel had geen verborgen voordelen of bijwerkingen en verspreidde zich via drift.

Conclusies

Uit het onderzoek bleek dat het vervangen van één enkel aminozuur in het FREP1-eiwit en het veranderen van de overerving met behulp van een gen-drive Anopheles stephensi vrijwel immuun zou kunnen maken voor malaria – zowel bij mensen als bij knaagdieren – zonder de levensvatbaarheid van de muggen in gevaar te brengen.

Deze aanpak vormt een aanvulling op bestaande maatregelen (netten, insecticiden, geneesmiddelen) waarvan de effectiviteit door resistentie afneemt. Een dergelijk systeem kan ook worden gebruikt om de gevoeligheid voor insecticiden te herstellen of andere beschermende allelen te introduceren.

Voordat de technologie kan worden geïmplementeerd, zijn er strikte milieu-, ethische en bestuurlijke kaders nodig, evenals systemen voor het controleren van de verspreiding.