Stamcellen en regeneratieve plastische geneeskunde

Tegenwoordig zijn er maar weinig praktiserende artsen die niet op de hoogte zijn van de ontwikkeling van een nieuwe richting in de behandeling van de meest ernstige ziekten, die voorheen ongeneeslijk waren met traditionele en alternatieve geneeswijzen. We hebben het over regeneratief-plastische geneeskunde, gebaseerd op het gebruik van het regeneratieve potentieel van stamcellen. Er is een ongekende wetenschappelijke discussie en pseudowetenschappelijke hype ontstaan rond deze richting, grotendeels gecreëerd dankzij de informatiehyperbolen van het World Wide Web. In zeer korte tijd zijn laboratoriumstudies naar de therapeutische mogelijkheden van stamcellen verder gegaan dan het experiment en zijn ze actief geïntroduceerd in de praktische geneeskunde, wat heeft geleid tot een reeks problemen van wetenschappelijke, ethische, religieuze, juridische en wetgevende aard. Overheids- en overheidsinstellingen blijken duidelijk niet voorbereid te zijn op de snelle overgang van stamcellen van petrischaaltjes naar systemen voor intraveneuze toediening, die noch de samenleving als geheel, noch een specifiek lijdend persoon ten goede komt. Het is niet eenvoudig om de onvoorstelbare hoeveelheid informatie over de mogelijkheden van stamcellen te doorgronden, zowel qua kwantiteit als kwaliteit. Dat geldt zelfs voor specialisten (en die zijn er niet, want iedereen probeert zich de nieuwe wetenschappelijke trends eigen te maken). Laat staan voor artsen die niet direct betrokken zijn bij regeneratieve plastische geneeskunde.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Waarom zijn zulke experimenten nodig? Zijn ze überhaupt nodig?

Op het eerste gezicht is de creatie van cellulaire interspecies chimaera's het resultaat van de ongebreidelde fantasie van een fanatieke wetenschapper die de bio-ethiek is vergeten. Het is echter deze aanpak die onze fundamentele kennis van embryogenese aanzienlijk heeft uitgebreid, omdat het mogelijk is geworden om het aantal cellen te berekenen dat nodig is voor organogenese (de vorming van de lever, hersenen, huid en organen van het immuunsysteem). Bovendien (misschien is dit wel het belangrijkste in de ESC-biologie) hebben genetici een uniek instrument tot hun beschikking gekregen waarmee het functionele doel van genen kan worden vastgesteld tijdens de chimerisatie van embryo's. Eerst wordt een speciale dubbele knock-outtechniek gebruikt om het bestudeerde genenpaar in ESC's "uit te schakelen". Vervolgens worden dergelijke ESC's in een blastocyst ingebracht en worden de veranderingen die optreden in het lichaam van het zich ontwikkelende chimere embryo gevolgd. Op deze manier werden de functies vastgesteld van de genen sf-1 (ontwikkeling van de bijnier en geslachtsorganen), urt-l (nieraanleg), muoD (ontwikkeling van skeletspieren) en gata-l-4 (aanleg van erytropoëse en lymfopoëse). Daarnaast kunnen nog niet onderzochte menselijke genen in de ES-cellen van proefdieren worden ingebracht (getransfecteerd) om hun functie te bepalen met behulp van een chimeer embryo.

Maar het rechtvaardigen van een experiment door het verkrijgen van nieuwe fundamentele kennis vindt doorgaans geen steun bij een breed publiek. Laten we een voorbeeld geven van de toegepaste betekenis van chimerisatie met behulp van ES-cellen. Ten eerste is dit xenotransplantatie, dat wil zeggen de transplantatie van dierlijke organen naar mensen. Theoretisch gezien stelt de creatie van chimeren van mens-varkenscellen ons in staat om een dier te verkrijgen dat qua antigene eigenschappen veel dichter bij de ES-donor staat, wat in verschillende klinische situaties (diabetes mellitus, levercirrose) het leven van een ziek persoon kan redden. Toegegeven, hiervoor moeten we eerst leren hoe we de eigenschap van totipotentie kunnen terugbrengen naar het genoom van een volwassen somatische cel, waarna deze kan worden geïntroduceerd in een zich ontwikkelend varkensembryo.

Tegenwoordig wordt het vermogen van ES-cellen om zich onder speciale kweekomstandigheden vrijwel oneindig te delen, gebruikt om totipotente celmassa's te produceren, die vervolgens differentiëren tot gespecialiseerde cellen, zoals dopaminerge neuronen. Deze cellen worden vervolgens getransplanteerd naar een patiënt met de ziekte van Parkinson. In dit geval gaat de transplantatie noodzakelijkerwijs vooraf aan een gerichte differentiatie van de verkregen celmassa tot gespecialiseerde cellen die nodig zijn voor de behandeling en zuivering van deze cellen uit ongedifferentieerde celelementen.

Zoals later bleek, was de dreiging van carcinogenese lang niet het enige obstakel voor celtransplantatie. ES-cellen in embryonale lichamen differentiëren spontaan heterogeen, dat wil zeggen dat ze derivaten vormen van een grote verscheidenheid aan cellijnen (neuronen, keratinocyten, fibroblasten, endotheliocyten). In het gezichtsveld van de microscoop onderscheiden cardiomyocyten zich in dit geval van cellen met verschillende fenotypes, die elk in hun eigen ritme samentrekken. Om een patiënt te behandelen, zijn echter zuivere celpopulaties nodig: neuronen - bij een beroerte, cardiomyocyten - bij een hartinfarct, β-cellen van de pancreas - bij diabetes mellitus, keratinocyten - bij brandwonden, enz.

De volgende fase in de ontwikkeling van celtransplantatie was verbonden met de ontwikkeling van technologieën om een voldoende aantal (miljoenen cellen) van dergelijke zuivere celpopulaties te verkrijgen. De zoektocht naar factoren die de gerichte differentiatie van ESC's veroorzaken, was empirisch van aard, aangezien de volgorde van hun synthese tijdens de embryogenese onbekend bleef. Aanvankelijk werd vastgesteld dat de vorming van de dooierzak wordt geïnduceerd door toevoeging van cAMP en retinoïnezuur aan de ESC-kweek. Hematopoëtische cellijnen werden gevormd in aanwezigheid van 1L-3, SCF, fibroblastgroeifactor (FGH), insulineachtige groeifactor (IGF-1), 1L-6 en granulocytkoloniestimulerende factor (G-СSF) in het kweekmedium. Zenuwstelselcellen werden gevormd uit ESC's na verwijdering van LIF en de fibroblastlaag, die als feeder diende. Na behandeling met retinoïnezuur in aanwezigheid van foetaal serum begonnen ES-cellen te differentiëren tot neuronen, en werden cardiomyocyten verkregen door toevoeging van dimethylsulfoxide (DMSO), dat zorgt voor gerichte afgifte van hydrofobe signaalmoleculen aan de celkern. In dit geval droegen de accumulatie van actieve zuurstofsoorten in het kweekmedium, evenals elektrische stimulatie, bij aan de vorming van volwassen contractiele cardiomyocyten.

Er werden enorme inspanningen en middelen geleverd om de omstandigheden te vinden voor de differentiatie van ES-cellen tot insulineproducerende cellen van de pancreas. Al snel werd echter duidelijk dat een aantal gespecialiseerde cellijnen (β-cellen van de pancreas, immuun- en endocriene cellen, adipocyten) niet uit ES-cellen ontstaan wanneer ze gestimuleerd worden volgens het principe van "één stimulerende factor - één cellijn". Dit principe bleek slechts voor een beperkt aantal cellijnen te gelden. Met name de vorming van neuronen kan geïnduceerd worden door retinoïnezuur, spiercellijn door transformerende groeifactor-β (TCP-β), erytroïde lijnen door 1L-6, monocytisch-myeloïde lijn door 1L-3. Bovendien bleken de effecten van deze factoren op de differentiatie van ES-cellen strikt dosisafhankelijk.

De fase van het zoeken naar combinaties van groeifactoren die ES-cellen zouden kunnen bevorderen tot latere stadia van de embryogenese met de vorming van mesoderm (de bron van cardiomyocyten, skeletspieren, niertubuli-epitheel, myelo-erytropoëse en gladde spiercellen), ectoderm (epidermis, neuronen, retina) en endoderm (epitheel van de dunne darm en secretieklieren, pneumocyten) begon. De natuur leek onderzoekers te dwingen om verder te gaan op het pad van de embryogenese, door de stadia te herhalen in een petrischaal, waardoor ze niet de mogelijkheid kregen om direct en gemakkelijk het gewenste resultaat te verkrijgen. En dergelijke combinaties van groeifactoren werden gevonden. Activine A in combinatie met TGF-β bleek een krachtige stimulator te zijn van de vorming van mesodermale cellen uit ES-cellen, terwijl de ontwikkeling van het endoderm en ectoderm werd geblokkeerd. Retinoïnezuur en een combinatie van beenmergmorfogenetisch proteïne (BMP-4) en epidermale groeifactor (EGF)-signalen activeren de vorming van ecto- en mesodermcellen, waardoor de ontwikkeling van het endoderm wordt gestopt. Intensieve celgroei van alle drie de kiembladen wordt waargenomen met het gelijktijdige effect van twee factoren op ES-cellen: hepatocytgroeifactor (HGF) en zenuwcelgroeifactor.

Om de benodigde cellijnen te verkrijgen, is het daarom noodzakelijk om eerst embryonale stamcellen over te brengen naar het stadium van de vorming van cellen in een bepaalde kiemlaag. Vervolgens wordt een nieuwe combinatie van groeifactoren geselecteerd die de gerichte differentiatie van ecto-, meso- en endodermcellen kan induceren tot gespecialiseerde cellen die nodig zijn voor transplantatie naar de patiënt. Het aantal combinaties van groeifactoren loopt tegenwoordig in de duizenden, de meeste zijn gepatenteerd en sommige worden helemaal niet bekendgemaakt door biotechbedrijven.

Het was tijd om de verkregen cellen te zuiveren van ongedifferentieerde cellulaire onzuiverheden. De in de kweek gedifferentieerde cellen werden gelabeld met markers van volwassen cellijnen en door een snelle laserimmunofenotypische sorter geleid. De laserstraal vond ze in de algemene cellulaire stroom en leidde ze langs een apart pad. Proefdieren waren de eersten die het verkregen gezuiverde celmateriaal ontvingen. Het was tijd om de effectiviteit van het gebruik van ESC-derivaten op modellen van ziekten en pathologische processen te evalueren. Een van dergelijke modellen was de experimentele ziekte van Parkinson, die bij dieren goed wordt gereproduceerd met behulp van chemische verbindingen die dopaminerge neuronen vernietigen. Omdat de ziekte bij mensen gebaseerd is op een verworven deficiëntie van dopaminerge neuronen, was het gebruik van vervangende celtherapie in dit geval pathogenetisch gerechtvaardigd. Bij dieren met experimenteel hemiparkinsonisme wortelde ongeveer de helft van de dopaminerge neuronen, afkomstig van ESC's en ingebracht in de hersenstructuren. Dit was voldoende om de klinische manifestaties van de ziekte significant te verminderen. Pogingen om de functie van beschadigde CZS-structuren te herstellen bij experimentele beroertes, verwondingen en zelfs scheuringen in het ruggenmerg, bleken behoorlijk succesvol.

Er moet echter worden opgemerkt dat bijna alle gevallen van succesvol gebruik van gedifferentieerde ESC-derivaten voor de correctie van experimentele pathologie plaatsvonden in de acute periode van de gesimuleerde pathologische situatie. De resultaten van behandeling op afstand waren niet zo geruststellend: na 8-16 maanden verdween of nam het positieve effect van celtransplantatie sterk af. De redenen hiervoor zijn duidelijk. Differentiatie van getransplanteerde cellen in vitro of in loco morbi leidt onvermijdelijk tot de expressie van cellulaire markers van genetische vreemdheid, wat een immuunaanval vanuit het lichaam van de ontvanger uitlokt. Om het probleem van immunologische incompatibiliteit op te lossen, werd traditionele immunosuppressie gebruikt, parallel daaraan begonnen klinische studies het potentieel te realiseren van transdifferentiatie en genetische correctie van autologe hematopoëtische en mesenchymale stamcellen die geen immuunconflict veroorzaken.

Wat is regeneratieve plastische geneeskunde?

De evolutie heeft twee belangrijke opties voor het einde van het leven van een cel bepaald: necrose en apoptose. Deze opties komen op weefselniveau overeen met de processen van proliferatie en regeneratie. Proliferatie kan worden beschouwd als een soort offer, waarbij het defect van beschadigd weefsel wordt opgevuld door vervanging door bindweefselelementen: met behoud van de structurele integriteit verliest het lichaam gedeeltelijk de functie van het aangetaste orgaan, wat de daaropvolgende ontwikkeling van compenserende reacties bepaalt met hypertrofie of hyperplasie van de structurele en functionele elementen die intact blijven. De duur van de compensatieperiode hangt af van de omvang van de structurele laesies veroorzaakt door de factoren van primaire en secundaire verandering, waarna in de overgrote meerderheid van de gevallen decompensatie optreedt, een sterke verslechtering van de kwaliteit en een verkorting van de duur van het menselijk leven. Fysiologische regeneratie zorgt voor remodelleringsprocessen, dat wil zeggen de vervanging van verouderende en stervende cellen door de mechanismen van natuurlijke celdood (apoptose) door nieuwe cellen afkomstig uit de stamcelreserves van het menselijk lichaam. Bij de processen van herstellende regeneratie zijn ook de cellulaire hulpbronnen van de stamcellen betrokken. Deze worden echter gemobiliseerd onder pathologische omstandigheden die verband houden met ziekte of weefselschade, waarbij celdood wordt geïnitieerd via necrosemechanismen.

De grote aandacht van wetenschappers, artsen, pers, televisie en publiek voor het onderzoek naar de biologie van embryonale stamcellen (ESC) is in de eerste plaats te danken aan het grote potentieel van cellulaire of, zoals wij het noemen, regeneratieve plastische therapie. De ontwikkeling van methoden voor de behandeling van de ernstigste menselijke ziekten (degeneratieve pathologie van het centrale zenuwstelsel, ruggenmerg- en hersenletsel, de ziekte van Alzheimer en Parkinson, multiple sclerose, hartinfarct, arteriële hypertensie, diabetes mellitus, auto-immuunziekten en leukemie, brandwonden en neoplastische processen vormen een verre van volledige lijst) is gebaseerd op de unieke eigenschappen van stamcellen, die het mogelijk maken om nieuw weefsel te creëren ter vervanging van, zoals voorheen werd aangenomen, onherstelbaar beschadigde weefselgebieden van een ziek organisme.

De vooruitgang in theoretisch onderzoek naar stamcelbiologie in de afgelopen 10 jaar is gerealiseerd door spontaan opkomende gebieden binnen de opkomende regeneratief-plastische geneeskunde, waarvan de methodologie niet alleen zeer geschikt is voor systematisering, maar dit ook vereist. Het eerste en zich snelst ontwikkelende gebied voor praktisch gebruik van het regeneratieve potentieel van stamcellen is de vervangende regeneratief-plastische therapie. De weg hiernaar is vrij gemakkelijk te volgen in de wetenschappelijke literatuur - van experimenten met dieren met myocardnecrose tot de studies van de afgelopen jaren die gericht zijn op het herstellen van het post-infarct tekort aan cardiomyocyten of het aanvullen van het verlies aan β-cellen van de pancreas en dopaminerge neuronen van het centrale zenuwstelsel.

Celtransplantatie

De basis van de substitutieve regeneratieve plastische geneeskunde is celtransplantatie. Deze laatste moet worden gedefinieerd als een complex van medische handelingen, waarbij het lichaam van de patiënt gedurende korte of lange tijd direct in contact komt met levensvatbare cellen van auto-, allo-, iso- of xenogene oorsprong. De celtransplantatiemethode is een suspensie van stamcellen of derivaten daarvan, gestandaardiseerd op basis van het aantal transplantatie-eenheden. Een transplantatie-eenheid is de verhouding tussen het aantal kolonievormende eenheden in de kweek en het totale aantal getransplanteerde cellen. Methoden voor celtransplantatie: intraveneuze, intraperitoneale, subcutane toediening van een suspensie van stamcellen of derivaten daarvan; toediening van een suspensie van stamcellen of derivaten daarvan in de hersenventrikels, lymfevaten of hersenvocht.

Allo- en autologe celtransplantatie maken gebruik van twee fundamenteel verschillende methodologische benaderingen voor de implementatie van het pluri-, multi- of polypotente potentieel van stamcellen: in vivo of in vitro. In het eerste geval worden de stamcellen in het lichaam van de patiënt ingebracht zonder voorafgaande differentiatie, in het tweede geval vindt na reproductie in kweek gerichte differentiatie en zuivering uit ongedifferentieerde elementen plaats. Onder de talrijke methodologische technieken van vervangende celtherapie worden drie groepen methoden duidelijk onderscheiden: vervanging van beenmerg- en bloedcellen, vervanging van orgaan- en weke delencellen, vervanging van rigide en vaste lichaamselementen (kraakbeen, bot, pezen, hartkleppen en capacitieve vaten). Deze laatste richting moet worden gedefinieerd als reconstructieve en regeneratieve geneeskunde, aangezien het differentiatiepotentieel van stamcellen wordt gerealiseerd op een matrix – een biologisch inerte of absorbeerbare structuur in de vorm van het vervangen lichaamsdeel.

Een andere manier om de intensiteit van regeneratief-plastische processen in beschadigd weefsel te verhogen, is door de eigen stamcellen van de patiënt te mobiliseren met behulp van exogene groeifactoren, zoals granulocyten en granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factoren. In dit geval leidt de breuk van stromaverbindingen tot een toename van de afgifte van hematopoëtische stamcellen in de bloedbaan, die in het gebied van weefselschade dankzij hun inherente plasticiteit regeneratieprocessen mogelijk maken.

De methoden van de regeneratieve geneeskunde zijn er dus op gericht om de processen van herstel van verloren functies te stimuleren, hetzij door de mobilisatie van de eigen stamcellen van de patiënt, hetzij door het inbrengen van allogeen celmateriaal.

Een belangrijk praktisch resultaat van de ontdekking van embryonale stamcellen is therapeutisch klonen, gebaseerd op inzicht in de triggers van embryogenese. Als het initiële signaal voor het begin van embryogenese het pre-mRNA-complex in het cytoplasma van de eicel is, dan zou de introductie van de kern van een somatische cel in de ontkernde eicel het embryonale ontwikkelingsprogramma moeten activeren. Vandaag de dag weten we al dat ongeveer 15.000 genen betrokken zijn bij de implementatie van het embryogeneseprogramma. Wat gebeurt er later met hen, na de geboorte, tijdens de periodes van groei, rijping en veroudering? Het antwoord op deze vraag werd gegeven door het schaap Dolly: ze worden bewaard. Met behulp van de modernste onderzoeksmethoden is bewezen dat de kernen van volwassen cellen alle codes behouden die nodig zijn voor de vorming van embryonale stamcellen, kiembladen, organogenese en restrictierijping (uitgang naar differentiatie en specialisatie) van cellijnen van mesenchymale, ecto-, endo- en mesodermale oorsprong. Therapeutisch klonen is als richting al in de vroegste ontwikkelingsfasen van de celtransplantologie ontstaan en zorgt voor het terugbrengen van totipotentie in de eigen somatische cellen van de patiënt om genetisch identiek transplantatiemateriaal te verkrijgen.

De ontdekking van stamcellen begon "vanaf het einde", aangezien de term die door A. Maksimov in de biologie en geneeskunde werd geïntroduceerd, verwees naar beenmergstamcellen, waaruit alle volwassen celelementen van het perifere bloed ontstaan. Hematopoëtische stamcellen hebben echter, net als cellen van alle weefsels van een volwassen organisme, ook hun eigen, minder gedifferentieerde voorloper. De gemeenschappelijke bron voor absoluut alle somatische cellen is de embryonale stamcel. Opgemerkt moet worden dat de concepten "embryonische stamcellen" en "embryo stamcellen" geenszins identiek zijn. Embryonale stamcellen werden door J. Thomson geïsoleerd uit de binnenste celmassa van de blastocyst en overgebracht naar langlevende cellijnen. Alleen deze cellen hebben een facsimile van "ESC". Leroy Stevens, die embryonale stamcellen ontdekte in experimenten met muizen, noemde ze "embryonische pluripotente stamcellen", verwijzend naar het vermogen van ESC's om te differentiëren tot derivaten van alle drie de kiembladen (ecto-, meso- en endoderm). Alle cellen van het embryo in latere ontwikkelingsstadia zijn echter ook stamcellen, omdat ze een enorm aantal cellen vormen die het lichaam van een volwassene vormen. Om ze te definiëren, stellen we de term "embryonale pluripotente voorlopercellen" voor.

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Soorten stamcellen

De moderne classificatie van stamcellen is gebaseerd op het principe van hun deling door hun vermogen (potentie) om cellijnen te vormen, wat gedefinieerd wordt als toti-, pluri-, multi-, poly-, bi- en unipotentie. Totipotentie, dat wil zeggen het vermogen om een genetisch geprogrammeerd organisme als geheel te herscheppen, is aanwezig in zygotecellen, blastomeren en embryonale stamcellen (cellen van de binnenste massa van de blastocyst). Een andere groep totipotente cellen, die in latere stadia van de embryonale ontwikkeling worden gevormd, wordt vertegenwoordigd door primaire kiemcellen van de embryonale genitale zone (genitale knobbels). Pluripotentie, het vermogen om te differentiëren tot cellen van elk orgaan of weefsel, is inherent aan embryonale cellen van de drie kiembladen: ecto-, meso- en endoderm. Er wordt aangenomen dat multipotentie, d.w.z. het vermogen om binnen één gespecialiseerde lijn willekeurige cellen te vormen, slechts kenmerkend is voor twee soorten cellen: de zogenaamde mesenchymale stamcellen, die in de neurale lijst worden gevormd en de voorlopercellen zijn van alle cellen van de bindweefselbasis van het lichaam, inclusief neurogliacellen, en hematopoëtische hematopoëtische stamcellen, die aanleiding geven tot alle bloedcellen. Daarnaast worden bi- en unipotente stamcellen onderscheiden, met name de voorlopercellen van de myeloïde, lymfoïde, monocytaire en megakaryocytaire hematopoëtische spruiten. Het bestaan van unipotente stamcellen is duidelijk bewezen aan de hand van het voorbeeld van levercellen - het verlies van een aanzienlijk deel van het leverweefsel wordt gecompenseerd door de intensieve deling van gedifferentieerde polyploïde hepatocyten.

Tijdens de ontwikkeling worden alle organen en weefsels gevormd door de proliferatie en differentiatie van de binnenste celmassa van de blastocyst, waarvan de cellen strikt genomen totipotente embryonale stamcellen zijn. Evans verrichtte zijn eerste werk op het gebied van de isolatie van embryonale stamcellen. Hij toonde aan dat blastocysten die in de hersenen van muizen worden geïmplanteerd, teratocarcinomen veroorzaken. De cellen hiervan vormen, na kloning, rijen van pluripotente embryonale stamcellen (de oorspronkelijke naam van deze cellen - embryonale carcinoomcellen of, in de afkorting, ECС - wordt momenteel niet gebruikt). Deze gegevens werden bevestigd in een aantal andere studies waarin embryonale stamcellen werden verkregen door blastocystcellen van muizen en andere diersoorten, evenals mensen, te kweken.

De laatste jaren wordt in de literatuur steeds meer melding gemaakt van de plasticiteit van stamcellen. Deze plasticiteit wordt niet alleen beschouwd als het vermogen van stamcellen om te differentiëren tot verschillende celtypen in verschillende ontwikkelingsstadia, maar ook om dedifferentiatie (transdifferentiatie, retrodifferentiatie) te ondergaan. Dat wil zeggen dat de fundamentele mogelijkheid wordt erkend om een somatisch gedifferentieerde cel terug te brengen naar het stadium van embryonale ontwikkeling met recapitulatie (terugkeer) van pluripotentie en de implementatie ervan in herhaalde differentiatie met de vorming van cellen van een ander type. In het bijzonder wordt gerapporteerd dat hematopoëtische stamcellen in staat zijn tot transdifferentiatie met de vorming van hepatocyten, cardiomyoblasten en endotheliocyten.

Er vinden nog steeds wetenschappelijke debatten plaats over de deling van stamcellen op basis van hun plasticiteit. Dat wil zeggen dat de terminologie en de verklarende woordenlijst van celtransplantatie nog in ontwikkeling zijn. Deze hebben directe praktische betekenis, aangezien de meeste methoden van regeneratieve plastische geneeskunde gebaseerd zijn op het gebruik van plastische eigenschappen en het vermogen van stamcellen om te differentiëren tot verschillende cellijnen.

Het aantal publicaties op het gebied van fundamentele en toegepaste problemen van regeneratief-plastische geneeskunde neemt snel toe. Er is al een scala aan verschillende methodologische benaderingen geschetst die gericht zijn op het optimaal benutten van het regeneratief-plastische potentieel van stamcellen. Cardiologen en endocrinologen, neurologen en neurochirurgen, transplantologen en hematologen hebben hun aandachtsgebieden geïdentificeerd. Oogartsen, tthisiologen, longartsen, nefrologen, oncologen, genetici, kinderartsen, gastro-enterologen, therapeuten en kinderartsen, chirurgen en gynaecologen zoeken naar oplossingen voor dringende problemen met de plastische capaciteiten van stamcellen – allemaal vertegenwoordigers van de moderne geneeskunde hopen de mogelijkheid te krijgen om ziekten te genezen die voorheen als fataal werden beschouwd.

Is celtransplantatie het nieuwe wondermiddel?

Deze vraag rijst terecht bij alle nadenkende artsen en wetenschappers die de huidige stand van de medische wetenschap analyseren. De situatie wordt gecompliceerd door het feit dat aan de ene kant van het veld van wetenschappelijke confrontatie "gezonde conservatieven" staan, en aan de andere kant - "zieke fanatici" van de celtransplantatie. De waarheid ligt uiteraard, zoals altijd, tussen hen - in het "niemandsland". Laten we, zonder de kwesties van recht, ethiek, religie en moraal aan te raken, de voor- en nadelen van de aangewezen gebieden van regeneratief-plastische geneeskunde eens bekijken. De "lichte bries" van de eerste wetenschappelijke rapporten over de therapeutische mogelijkheden van ESG's veranderde een jaar na hun ontdekking in een "buiige wind", die in 2003 uitgroeide tot een "informatietornado". De eerste reeks publicaties betrof de kweek van embryonale stamcellen, hun reproductie en gerichte differentiatie in vitro.

Het bleek dat voor onbeperkte reproductie van embryonale stamcellen in kweek een aantal voorwaarden strikt in acht moeten worden genomen. Drie factoren moeten aanwezig zijn in het geconditioneerde medium: interleukine-6 (IL-6), stamcelfactor (SCF) en leukase-inhiberende factor (LIF). Bovendien moeten embryonale stamcellen worden gekweekt op een substraat (voedingslaag van cellen) van embryonale fibroblasten en in aanwezigheid van foetaal kalfsserum. Als aan deze voorwaarden wordt voldaan, groeien ESC's in kweek als klonen en vormen ze embryoïde lichamen - aggregaten van suspensieklonen van bolvormige cellen. Het belangrijkste kenmerk van de ESC-kloon is dat het embryoïde lichaam in kweek stopt met groeien wanneer er zich 50-60, maximaal 100 cellen in het aggregaat ophopen. Gedurende deze periode treedt een evenwichtstoestand op - de snelheid van celdeling in de kloon is gelijk aan de snelheid van apoptose (geprogrammeerde celdood) in de periferie. Na het bereiken van een dergelijk dynamisch evenwicht ondergaan de perifere cellen van het embryonale lichaam spontane differentiatie (meestal met de vorming van endodermale fragmenten van de dooierzak, angioblasten en endotheliocyten) met verlies van totipotentie. Om voldoende totipotente celmassa te verkrijgen, moet het embryonale lichaam daarom wekelijks worden gedesaggregeerd door transplantatie van individuele embryonale stamcellen naar een nieuw voedingsmedium – een vrij arbeidsintensief proces.

De ontdekking van embryonale stamcellen gaf geen antwoord op de vraag wat precies en hoe de embryogeneseprogramma's activeert die in het zygote-DNA versleuteld zijn. Het blijft onduidelijk hoe het genoomprogramma zich tijdens het menselijk leven ontvouwt. Tegelijkertijd maakte de studie van embryonale stamcellen het mogelijk om een concept te ontwikkelen van de mechanismen die de toti-, pluri- en multipotentie van stamcellen tijdens hun deling in stand houden. Het belangrijkste onderscheidende kenmerk van een stamcel is zijn vermogen tot zelfreproductie. Dit betekent dat een stamcel, in tegenstelling tot een gedifferentieerde cel, asymmetrisch deelt: één van de dochtercellen leidt tot een gespecialiseerde cellijn, en de tweede behoudt de toti-, pluri- of multipotentie van het genoom. Het bleef onduidelijk waarom en hoe dit proces plaatsvindt in de vroegste stadia van de embryogenese, wanneer de delende binnenste celmassa van de blastocyst volledig totipotent is en het ESC-genoom zich in een slapende (geremde) toestand bevindt. Als tijdens de deling van een gewone cel het duplicatieproces noodzakelijkerwijs voorafgegaan wordt door de activering en expressie van een heel complex van genen, dan gebeurt dit niet tijdens de deling van een ESC. Het antwoord op de vraag "waarom" werd verkregen na de ontdekking van reeds bestaand mRNA (pre-mRNA) in ESC's, waarvan een deel gevormd wordt in folliculaire cellen en opgeslagen wordt in het cytoplasma van de eicel en de zygote. De tweede ontdekking beantwoordde de vraag "hoe": speciale enzymen, "editasen" genaamd, werden in ESC's gevonden. Editasen vervullen drie belangrijke functies. Ten eerste zorgen ze voor alternatieve epigenetische (zonder deelname van het genoom) aflezing en duplicatie van pre-mRNA. Ten tweede implementeren ze het proces van pre-mRNA-activering (splicing - het verwijderen van intronen, dat wil zeggen inactieve delen van RNA die de eiwitsynthese op mRNA remmen), waarna de assemblage van eiwitmoleculen in de cel begint. Ten derde bevorderen editases de vorming van secundaire mRNA's, die genexpressiemechanismen onderdrukken en zo de dichte chromatinestapeling en de inactieve toestand van genen in stand houden. Eiwitproducten die op dergelijke secundaire mRNA's worden gesynthetiseerd en die silencer-eiwitten of genoombewakers worden genoemd, zijn aanwezig in menselijke eicellen.

Zo wordt het mechanisme van de vorming van onsterfelijke cellijnen van embryonale stamcellen vandaag de dag gepresenteerd. Simpel gezegd: het signaal om het embryogeneseprogramma te starten, waarvan de eerste fasen bestaan uit de vorming van totipotente celmassa, komt uit het cytoplasma van de eicel. Als in dit stadium de interne celmassa van de blastocyst, oftewel ESC, geïsoleerd wordt van verdere regulerende signalen, vindt het proces van zelfreproductie van cellen plaats in een gesloten cyclus zonder deelname van de genen van de celkern (epigenetisch). Als een dergelijke cel wordt voorzien van voedingsstoffen en geïsoleerd van externe signalen die de differentiatie van de celmassa bevorderen, zal ze zich eindeloos delen en reproduceren.

De eerste resultaten van experimentele pogingen om totipotente cellen te gebruiken voor transplantatie waren ronduit indrukwekkend: de introductie van embryonale stamcellen in de weefsels van muizen met een door immunosuppressiva verzwakt immuunsysteem leidde in 100% van de gevallen tot de ontwikkeling van tumoren. Onder de cellen van het neoplasma, waarvan ES-cellen de bron waren, bevonden zich gedifferentieerde derivaten van het totipotente, exogene celmateriaal, met name neuronen, maar de groei van teratocarcinomen reduceerde de waarde van de verkregen resultaten tot nul. Tegelijkertijd vormden ES-cellen, in de werken van L. Stevens, die in de buikholte werden ingebracht grote aggregaten waarin embryonale spieren, hart, haar, huid, botten, spieren en zenuwweefsel fragmentarisch werden gevormd. (Chirurgen die dermoïdcysten openden, zouden bekend moeten zijn met deze afbeelding). Interessant is dat zwevende embryoblastcellen van muizen zich op precies dezelfde manier gedragen: hun introductie in de weefsels van volwassen, immuungecompromitteerde dieren veroorzaakt altijd de vorming van teratocarcinomen. Wordt echter uit zo'n tumor een zuivere lijn van ES-cellen geïsoleerd en in de buikholte ingebracht, dan worden er eveneens gespecialiseerde somatische derivaten van alle drie de kiembladen gevormd, zonder tekenen van carcinogenese.

Het volgende probleem dat opgelost moest worden, was dus het zuiveren van het celmateriaal van onzuiverheden van ongedifferentieerde cellen. Zelfs met een zeer hoge efficiëntie van gerichte celdifferentiatie behoudt echter tot 20% van de cellen in de kweek hun totipotente potentieel, wat in vivo helaas tot uiting komt in tumorgroei. Een andere "katapult" van de natuur - op de schaal van medisch risico weegt de garantie op herstel van de patiënt op tegen de garantie op zijn dood.

De relatie tussen tumorcellen en embryonale pluripotente voorlopercellen (EPPC's), die verder in ontwikkeling zijn dan ES-cellen, is nogal dubbelzinnig. De resultaten van onze studies hebben aangetoond dat de introductie van EPPC's in verschillende transplanteerbare tumoren bij ratten kan leiden tot de desintegratie van tumorweefsel (G), een snelle toename van de tumormassa (D), de afname ervan (E-3), of geen invloed heeft op de grootte van spontane centrale focale necrose van neoplastisch weefsel (I, K). Het is duidelijk dat de uitkomst van de interactie tussen EPPC's en tumorcellen wordt bepaald door de totale set cytokines en groeifactoren die ze in vivo produceren.

Het is opmerkelijk dat embryonale stamcellen, die met carcinogenese reageren op contact met volwassen weefsels, perfect worden opgenomen door de celmassa van het embryo en zich integreren in alle organen van het embryo. Dergelijke chimaera's, bestaande uit de eigen cellen van het embryo en donor-ESC's, worden allofeendieren genoemd, hoewel ze in feite geen fenotypische chimaera's zijn. Het hematopoëtische systeem, de huid, het zenuwweefsel, de lever en de dunne darm ondergaan maximale cellulaire chimerisatie wanneer ESC's in een vroeg embryo worden geïntroduceerd. Er zijn gevallen van chimerisatie van de genitaliën beschreven. De enige zone die onschendbaar is voor ESC's zijn primaire kiemcellen.

Dat wil zeggen dat het embryo de genetische informatie van zijn ouders behoudt, waardoor de zuiverheid en het voortbestaan van zowel het geslacht als de soort gewaarborgd blijven.

Onder omstandigheden van blokkering van de celdeling van het vroege embryo met cytoclazine, leidt de introductie van embryonale stamcellen in de blastocyst tot de ontwikkeling van een embryo waarvan de primaire kiemcellen, net als alle andere, gevormd zijn uit embryonale stamcellen van donoren. Maar in dit geval is het embryo zelf volledig donor, genetisch vreemd aan het lichaam van de draagmoeder. De mechanismen van een dergelijke natuurlijke blokkering van het potentieel voor vermenging van eigen en vreemde erfelijke informatie zijn nog niet opgehelderd. Aangenomen kan worden dat in dit geval het apoptoseprogramma wordt gerealiseerd, waarvan de determinanten ons nog niet bekend zijn.

Opgemerkt moet worden dat de embryogenese van dieren van verschillende soorten nooit gecoördineerd is: bij de implementatie van het donorprogramma van organogenese in het lichaam van het ontvangende embryo van xenogene embryonale stamcellen, sterft het embryo in utero en wordt het geresorbeerd. Daarom moet het bestaan van de chimaera's "rat-muis", "varken-koe", "mens-rat" worden begrepen als cellulair, maar niet als morfologisch mozaïcisme. Met andere woorden, wanneer ES-cellen van een zoogdiersoort in de blastocyst van een andere soort worden geïntroduceerd, ontwikkelen zich altijd nakomelingen van de moedersoort, waarin zich tussen hun eigen cellen van bijna alle organen insluitsels bevinden, en soms clusters van structurele en functionele eenheden bestaande uit genetisch vreemd materiaal van ES-derivaten. De term "gehumaniseerd varken" kan niet worden opgevat als een aanduiding van een soort monster begiftigd met intelligentie of uiterlijke kenmerken van een mens. Dit is slechts een dier waarvan een deel van de lichaamscellen afkomstig is van menselijke ES-cellen die in de blastocyst van een varken zijn geïntroduceerd.

Vooruitzichten voor het gebruik van stamcellen

Het is al lang bekend dat ziekten die verband houden met de genopathologie van hematopoëtische en lymfoïde cellen vaak worden geëlimineerd na allogene beenmergtransplantatie. Vervanging van eigen hematopoëtisch weefsel door genetisch normale cellen van een verwante donor leidt tot gedeeltelijk en soms volledig herstel van de patiënt. Onder de genetische ziekten die met allogene beenmergtransplantatie worden behandeld, zijn het gecombineerde immunodeficiëntiesyndroom, X-gebonden agammaglobulinemie, chronische granulomatose, het syndroom van Wiskott-Aldrich, de ziekten van Gaucher en Hurler, adrenoleukodystrofie, metachromatische leukodystrofie, sikkelcelanemie, thalassemie, Fanconi-anemie en aids het vermelden waard. Het grootste probleem bij het gebruik van allogene beenmergtransplantatie bij de behandeling van deze ziekten heeft te maken met de selectie van een HbA-compatibele verwante donor. Voor een succesvolle zoektocht zijn gemiddeld 100.000 monsters getypeerd hematopoëtisch donorweefsel nodig.

Gentherapie maakt het mogelijk om een genetisch defect direct in de hematopoëtische stamcellen van de patiënt te corrigeren. Theoretisch biedt gentherapie dezelfde voordelen bij de behandeling van genetische aandoeningen van het hematopoëtische systeem als allogene beenmergtransplantatie, maar zonder alle mogelijke immunologische complicaties. Dit vereist echter een techniek die de effectieve overdracht van een volwaardig gen naar hematopoëtische stamcellen mogelijk maakt en het vereiste niveau van expressie ervan handhaaft, wat bij bepaalde erfelijke aandoeningen mogelijk niet erg hoog is. In dit geval geeft zelfs een geringe aanvulling van het eiwitproduct van het deficiënte gen een positief klinisch effect. Met name bij hemofilie B is 10-20% van de normale factor IX-spiegel voldoende om het interne bloedstollingsmechanisme te herstellen. Genetische modificatie van autoloog celmateriaal is succesvol gebleken bij experimenteel hemiparkinsonisme (unilaterale vernietiging van dopaminerge neuronen). Transfectie van embryonale fibroblasten van ratten met een retrovirale vector die het tyrosinehydroxylase-gen bevat, zorgde voor de synthese van dopamine in het centrale zenuwstelsel: intracerebrale toediening van getransfecteerde fibroblasten verminderde de intensiteit van de klinische verschijnselen van een experimenteel model van de ziekte van Parkinson bij proefdieren aanzienlijk.

Het vooruitzicht om stamcellen te gebruiken voor gentherapie van menselijke ziekten heeft clinici en experimentatoren voor veel nieuwe uitdagingen gesteld. De problematische aspecten van gentherapie hangen samen met de ontwikkeling van een veilig en effectief systeem voor gentransport naar de doelcel. Momenteel is de efficiëntie van genoverdracht naar grote zoogdiercellen zeer laag (1%). Methodisch wordt dit probleem op verschillende manieren opgelost. In-vitro-genoverdracht omvat transfectie van genetisch materiaal in de cellen van de patiënt in kweek, waarna deze cellen worden teruggeplaatst in het lichaam van de patiënt. Deze aanpak zou als optimaal moeten worden beschouwd bij het gebruik van genen die in beenmergstamcellen zijn ingebracht, aangezien de methoden voor het overbrengen van hematopoëtische cellen van het lichaam naar kweek en terug goed bekend zijn. Retrovirussen worden het vaakst gebruikt voor genoverdracht naar hematopoëtische cellen in vitro. Het grootste deel van de hematopoëtische stamcellen bevindt zich echter in een inactieve toestand, wat het transport van genetische informatie met behulp van retrovirussen bemoeilijkt en een zoektocht vereist naar nieuwe manieren voor effectief gentransport naar inactieve stamcellen. Momenteel worden genoverdrachtsmethoden zoals transfectie, directe micro-injectie van DNA in cellen, lipofectie, elektroporatie, "genenkanon", mechanische koppeling met behulp van glasparels, transfectie van hepatocyten met receptorafhankelijke DNA-koppeling aan asialoglycoproteïne en aerosolintroductie van het transgen in de cellen van het alveolaire epitheel van de longen gebruikt. De efficiëntie van DNA-overdracht met deze methoden is 10,0-0,01%. Met andere woorden, afhankelijk van de methode voor het inbrengen van genetische informatie, kan succes worden verwacht bij 10 op de 100 patiënten of bij 1 op de 10.000 patiënten. Het is duidelijk dat er nog geen effectieve en tegelijkertijd veilige methode voor de overdracht van therapeutische genen is ontwikkeld.

Een fundamenteel andere oplossing voor het probleem van afstoting van allogeen celmateriaal in de celtransplantatietechnologie is het gebruik van hoge doses embryonale pluripotente stamcellen om het effect van herinstallatie van het antigeenhomeostasecontrolesysteem van een volwassen organisme te bereiken (het Kukharchuk-Radchenko-Sirman-effect). De essentie hiervan ligt in de inductie van immunologische tolerantie door het creëren van een nieuwe basis van immunocompetente cellen met gelijktijdige herprogrammering van het antigeenhomeostasecontrolesysteem. Na toediening van hoge doses EPPC worden deze laatste gefixeerd in de weefsels van de thymus en het beenmerg. In de thymus differentiëren EPPC, onder invloed van een specifieke micro-omgeving, tot dendritische, interdigitate cellen en epitheliale-stromale elementen. Tijdens de differentiatie van EPPC's in de thymus van de ontvanger komen, samen met de eigen moleculen van het major histocompatibility complex (MHC), ook MHC-moleculen tot expressie die genetisch bepaald zijn in donorcellen. Dat wil zeggen dat er een dubbele standaard van MHC-moleculen wordt vastgesteld, op basis waarvan positieve en negatieve selectie van T-lymfocyten plaatsvindt.

De vernieuwing van de effectorlink van het immuunsysteem van de ontvanger vindt dus plaats via de bekende mechanismen van positieve en negatieve selectie van T-lymfocyten, maar via de dubbele standaard van MHC-moleculen - de EPPC's van de ontvanger en de donor.

Herprogrammering van het immuunsysteem met behulp van EPPC maakt niet alleen celtransplantatie mogelijk zonder langdurig gebruik van immunosuppressiva, maar opent ook volledig nieuwe perspectieven in de behandeling van auto-immuunziekten en biedt een basis voor de ontwikkeling van nieuwe ideeën over het menselijke verouderingsproces. Om de mechanismen van veroudering te begrijpen, hebben we een theorie over de uitputting van de stamcellen in het lichaam voorgesteld. Volgens de hoofdlijn van deze theorie is veroudering een permanente afname van de omvang van de stamcellen in het lichaam, die wordt opgevat als een verzameling regionale ("volwassen") stamcellen (mesenchymale, neuronale, hematopoëtische stamcellen, voorlopercellen van de huid, het spijsverteringskanaal, het endocriene epitheel, pigmentcellen van de ciliaire plooien, enz.), die de cellulaire verliezen van het overeenkomstige weefsel tijdens het proces van lichaamsremodellering aanvullen. Lichaamsremodellering is de vernieuwing van de cellulaire samenstelling van alle weefsels en organen dankzij stamcellen, die gedurende het hele leven van een meercellig organisme doorgaat. Het aantal cellen in de stamruimtes wordt genetisch bepaald, wat de beperkte grootte (proliferatiepotentieel) van elke stamruimte bepaalt. De grootte van de stamruimtes bepaalt op zijn beurt de snelheid van veroudering van individuele organen, weefsels en lichaamssystemen. Na uitputting van de cellulaire reserves van de stamruimtes worden de intensiteit en snelheid van veroudering van een meercellig organisme bepaald door de verouderingsmechanismen van somatisch gedifferentieerde cellen binnen de Hayflick-limiet.

Daarom kan de uitbreiding van stamcellen in de postnatale ontogenese niet alleen de levensduur aanzienlijk verlengen, maar ook de kwaliteit van leven verbeteren door het herstel van het remodellerende vermogen van het lichaam. De uitbreiding van stamcellen kan worden bereikt door de introductie van grote doses allogene embryonale pluripotente stamcellen, mits het immuunsysteem van de ontvanger tegelijkertijd wordt geherprogrammeerd, wat de levensduur van oudere muizen in het experiment aanzienlijk verlengt.

De theorie van stamceldepletie kan de bestaande ideeën over de mechanismen van veroudering veranderen, maar ook over de ziekte zelf, en de gevolgen van de medicamenteuze behandeling ervan. De ziekte kan zich met name ontwikkelen als gevolg van pathologie van stamcelcellen (oncopathologie). Uitputting van de mesenchymale stamcelreserve verstoort de processen van bindweefselremodellering, wat leidt tot het verschijnen van uiterlijke tekenen van veroudering (rimpels, slappe huid, cellulitis). Uitputting van de stamcelreserve van endotheelcellen veroorzaakt de ontwikkeling van arteriële hypertensie en atherosclerose. De aanvankelijk kleine omvang van de thymusstamcel bepaalt de vroege, permanente leeftijdsgebonden involutie. Vroegtijdige veroudering is een gevolg van de initiële pathologische afname van de omvang van alle stamcelruimtes in het lichaam. Medicamenteuze en niet-medicamenteuze stimulatie van stamcelreserves verbetert de kwaliteit van leven door de duur ervan te verkorten, omdat het de omvang van de stamcelruimtes verkleint. De lage efficiëntie van moderne geroprotectors komt doordat ze een beschermend effect hebben op verouderende gedifferentieerde somatische cellen, en niet op de stamcellen van het lichaam.

Tot slot willen we nogmaals benadrukken dat regeneratief-plastische geneeskunde een nieuwe richting is in de behandeling van menselijke ziekten, gebaseerd op het gebruik van het regeneratief-plastische potentieel van stamcellen. In dit geval wordt plasticiteit begrepen als het vermogen van exogene of endogene stamcellen om te worden geïmplanteerd en nieuwe, gespecialiseerde celgroei te veroorzaken in beschadigde weefselgebieden van een ziek organisme. Het doel van regeneratief-plastische geneeskunde zijn dodelijke menselijke ziekten die momenteel ongeneeslijk zijn, erfelijke pathologie, ziekten waarbij traditionele geneeswijzen slechts een symptomatisch effect bereiken, evenals anatomische defecten van het lichaam, waarvan het herstel het doel is van reconstructief-plastische regeneratieve chirurgie. Naar onze mening is het te vroeg om de eerste pogingen om complete en functioneel complete organen uit stamcellen te reconstrueren als een apart gebied van de praktische geneeskunde te beschouwen. Het onderwerp van regeneratief-plastische geneeskunde zijn stamcellen, die, afhankelijk van de bron van hun ontvangst, een verschillend regeneratief-plastisch potentieel hebben. De methodologie van regeneratieve plastische geneeskunde is gebaseerd op de transplantatie van stamcellen of derivaten daarvan.