Hemopoietische stamcellen van navelstrengbloed

Cordial blood fungeert als een bron van hematopoietische stamcellen op het proliferatieve vermogen en de repopulatiemogelijkheden van hematopoietische cellen. Er is herhaaldelijk aangetoond dat het navelstrengbloed op het moment van aflevering een voldoende groot aantal slecht toegewijde hematopoëtische progenitorcellen bevat. Sommige auteurs geloven dat het voordeel van het transplanteren van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed is dat er niet hoeft te worden gezocht naar een donor die compatibel is met HLA-antigenen. Volgens hen onrijpheid van het immuunsysteem oorzaken van de pasgeborene verminderde functionele activiteit van immunocompetente cellen en bijgevolg lager dan bij beenmergtransplantaties, de incidentie van ernstige reactie "graft versus host". In deze cel transplantaatoverleving van navelstrengbloed niet lager is dan beenmergcellen, zelfs bij gebruik van een kleiner aantal GSK toegediend per 1 kg lichaamsgewicht van de patiënt. Echter, naar onze mening, het optimale aantal vragen getransplanteerde navelstrengbloed cellen nodig voor een efficiënte implantatie in het lichaam van de ontvanger, hun immunologische verenigbaarheid en een aantal andere aspecten van transplantatie van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed vereist meer serieuze analyse.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]

Het verkrijgen van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed

De procedure voor het verkrijgen van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed moet de inname direct na de geboorte en de scheiding van de placenta, wanneer de placenta in utero of ex utero, alsmede voor keizersnede, maar ook ex utero. Er wordt aangetoond dat in het geval van een verkorting van de tijd vanaf de geboorte tot de scheiding van de pasgeborene en de placenta tot 30 seconden, het verkregen volume navelstrengbloed gemiddeld met 25-40 ml toeneemt. Bij een latere procedure gaat dezelfde hoeveelheid bloed verloren. Het staat vast dat de vroege scheiding van het kind en de bijverbranding geen negatieve gevolgen voor de pasgeborene met zich mee brengt.

De Russische Research Institute Hematologie en bloedtransfusie ontwikkelde doeltreffende en goedkope techniek voor zowel navelstrengbloed bij fysiologische lijnen ((70,2 + 25,8) ml) en keizersnede ((73,4 + 25,1) ml). Een werkwijze voor het scheiden van navelstrengbloed met een voldoende hoge opbrengst aan mononucleaire cellen en gekiemd - (83,1 + 9,6) en (83,4 + 14,1)% respectievelijk. Verbeterde werkwijze voor cryopreservatie van navelstrengbloed, die een hoge veiligheid van mononucleaire cellen en CFU-GM verzekert - (96,8 + 5,7) en (89,6 + 22,6)% respectievelijk. De efficiëntie van de drainagemethode voor navelstrengbloedafname met behulp van de "Kompoplast-300" -container (Rusland) werd bepaald. Fence navelstrengbloed auteurs uitgevoerd onmiddellijk na de geboorte en de scheiding van de placenta, in termen van het plaatsen van de placenta in de baarmoeder of ex baarmoeder. Vóór punctie van de navelstrengader navelstreng eenmaal behandeld met 5% jodium en vervolgens tweemaal - 70% ethylalcohol. Het bloed vloeide spontaan door de verbindingsbuizen naar de container. De duur van het hek duurde niet meer dan 10 minuten. 66 verzamelde drainagevolume Werkwijze navelstrengbloed monsters hadden een gemiddelde (72 + 28) ml, en het aantal leukocyten in het monster gemiddeld full - (1,1 + 0,6) x x 107. De analyse van navelstrengbloed steriliteit (bacteriële verontreiniging, HIV-1-virussen van hepatitis B en C, syfilis en cytomegalovirus infectie) slechts één monster geïdentificeerd IgG-antilichamen tegen hepatitis C. In een andere studie als de placenta na de geboorte foetale oppervlak een speciaal frame beneden, werd het koord behandeld met 5% natrium geplaatst jodium en 75% ethyl th alcohol. De aders van de navelstreng werden met een naald uit het transfusiesysteem (G16) afgetapt. Het bloed stroomde spontaan in de houder. Het aldus ingenomen bloedvolume was gemiddeld (55 + 25) ml. Het papier Kogler G. Et al (1996) navelstrengbloed genomen gesloten manier verkregen en grote hoeveelheden bloed - gemiddeld (79 + 26) ml. De auteurs merken op dat bij 574 navelstrengbloed bevat ongeveer 7% lager dan 40 ml bloed, dat niet toelaat te gebruiken voor transplantatie. K. Isoyama et al (1996), waarbij het navelstrengbloed met actieve exfusion gebruiken injectiespuiten, ingekomen gemiddeld 69,1 ml bloed (navelstrengbloed volume varieerde 15-135 ml). Tenslotte A. Abdel-Mageed PI medewerkers (1997) van veneuze katheterisatie punovinnoy verkregen in gemiddeld 94 ml navelstrengbloed (56-143 ml).

Om het risico van iatrogene infectie en verontreiniging met maternale afscheidingen ontwikkeld gesloten systeem bloedafname op basis van de gebruikte transfuzioinoy systeem Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA) verlagen, met 62,5 ml CPDA (citraat-fosfaat-dextrose met adenine) als antistollingsmiddel. De technologie voor het produceren van materiaal van het grootste belang voor de bereiding van een kwaliteit monster ten opzichte van de hoeveelheid inhoud en zuiverheid van de celsuspensie. Van de bestaande methoden navelstrengbloedverzamelinrichting, kotoryeuslovno ingedeeld in gesloten, halfopen en open systeem sleduetotdavat voorkeur eerst in een afgesloten systeem vermindert het risico van microbiële contaminatie van het materiaal, alsmede besmetting van de celsuspensie van de moedercel.

A. Nagler en co-auteurs (1998) voerden een vergelijkende analyse uit van de werkzaamheid van alle drie de navelstrengbloedbemonsteringssystemen. In de eerste variant werd de procedure uitgevoerd in een gesloten systeem door exsusie van bloed direct in de container. In de tweede variant werd navelstrengbloed verkregen door de werkwijze van actieve bloedexcusie van spuiten 1 met verder wassen van de bloedvaten van de placenta en gelijktijdige afvoer van bloed in de houder (open methode). In de derde variant werd het bloed onttrokken in een halfopen systeem door het actief te extraheren met spuiten en door de slagader van de navelstreng te spoelen met gelijktijdige exfusie in de houder. In de eerste uitvoeringsvorm, de auteurs verkregen in een volume van navelstrengbloed (76,4 + 32,1) ml van het gehalte aan leukocyten (10,5 + 3,6) x 10 ⁶ in 1 ml bloed. In de tweede uitvoeringsvorm zijn de overeenkomstige cijfers (174,4 + 42,8) en mL (8,8 + 3,4) x 10 ⁶ / ml; derde - (173,7 + 41,3) en mL (9,3 + 3,8) x 10 ⁶ / ml. De meest voorkomende infectie van bloedmonsters van navelstrengbloed werd opgemerkt bij gebruik van een open systeem. Een directe correlatie tussen de placentamassa en het volume geëxtraheerd bloed wordt vastgesteld - met toenemende placentamassa neemt de hoeveelheid verzameld bloed toe.

Na de bemonstering van navelstrengbloed volgt de scheidingsstap - isolatie van mononucleaire cellen en zuivering van de celsuspensie uit erythrocyten. Onder de experimentele omstandigheden worden de kernhoudende cellen geïsoleerd door de werkwijze van hun sedimentatie met methylcellulose tijdens de lysis van ammoniumerytrocyten door chloride. Voor klinische doeleinden mag methylcellulose echter niet worden gebruikt, omdat het verlies van hematopoietische stamcellen 50-90% bereikt. Lyseren van rode bloedcellen in het kader van grote volumes van de werkoplossing in de kliniek ook nauwelijks uitgevoerd, hoewel het percentage scheiding op deze wijze kernhoudende cellen met het fenotype van CD34 + en progenitorcellen CFU-GM functies en CFU-GEMM aanzienlijk hoger. Een nieuw middel voor de isolatie van mononucleaire cellen in de dichtheidsgradiënt buyant density solution (BDS72) is gerapporteerd. Deze stof heeft de volgende fysiologische parameters: pH - 7,4, osmolaliteit - 280 mosm / kg, dichtheid - 1,0720 g / ml. Volgens de auteurs is het mogelijk om tot 100% CD34-positieve cellen te isoleren en 98% van de rode bloedcellen te verwijderen. De kliniek past BDS72 echter nog niet toe.

De scheidingsmethoden getest kernhoudende cellen uit navelstrengbloed wordt gewoonlijk gebruik gemaakt van een 10% HES oplossing of 3% gelatineoplossing. Efficiëntie van precipitatie van erythrocyten en isolatie van genucleëerde cellen in beide gevallen is ongeveer gelijk. In het geval van gebruik als een bezinkende agens gelatine kan een iets groter aantal CFU-GM, dan bij HES te verkrijgen. Aangenomen wordt dat het verschil in herstelcapaciteit CFU-GM ongelijke snelheid als gevolg van afzetting van afzonderlijke fracties of kern bevattende cellen vermogen HES moleculen geabsorbeerd op hematopoietische celoppervlak receptoren en aldus blokkeren hun gevoeligheid voor koloniestimulerende factoren, die worden gebruikt bij het kweken van CFU-GM vitro. Desalniettemin kunnen beide sedimentatoren geschikt zijn voor het isoleren van genucleëerde cellen bij het creëren van grootschalige navelstrengbloedbanken.

Methoden voor scheiding en cryopreservatie van navelstrengbloed verschillen in principe niet van die gebruikt in het werk met hematopoietische stamcellen van perifeer bloed en beenmerg van volwassen donoren. Maar bij het voorbereiden van een groot aantal navelstrengbloedmonsters voor zijn banken, moeten de scheidingsmethoden allereerst goedkoop zijn. Daarom worden helaas, nu al voor klinische behoeften, routinematige methoden van isolatie en cryopreservatie van navelstrengbloedcellen gebruikt, en effectievere, maar financieel effectieve methoden blijven het grootste deel van de onderzoekers.

In het algemeen werden de criteria voor het schatten van het aantal hematopoietische cellen en de vereisten voor de studie van navelstrengbloedmonsters vastgesteld om infectieuze agentia te identificeren. Om de transplantatie van hematopoietische navelstrengbloedcellen veilig te stellen, moeten alle bloedmonsters in de eerste plaats worden onderzocht op hematogene infecties en genetische ziekten. Sommige auteurs bevelen aanvullende bijzondere methoden van de studie van navelstrengbloed voor het doel van de diagnose van genetische ziekten zoals thalassemie en sikkelcelanemie, adenosinedeaminasedeficiëntie, agammaglobulinemie Bruton, ziekte Harlera en punter.

Volgens de aanbevelingen Ticheli L. Et al (1998), in elk monster van navelstrengbloed moet het aantal kern bevattende cellen, SB34-positieve cellen en CFU-GM bepaling uitvoeren HLA-typering bloedgroep ABO en Rh zijn lidmaatschap bepalen. Bovendien wordt enten uitgevoerd bacteriologische, serologische tests voor HIV en CMV-infectie, HBsAg, hepatitis C, HTLV-I en HTLV-II (T-cel leukemie mens), syfilis, toxoplasmose. Een polymerasekettingreactie op cytomegalovirus en HIV-infectie is verplicht.

De procedure voor het verkrijgen van navelstrengbloed moet worden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de principes van medische bio-ethiek. Vóór de start van de bloedafname is het noodzakelijk om de toestemming van de zwangere vrouw voor de uitvoering ervan te verkrijgen. Een voorlopig interview met een zwangere vrouw voor het verkrijgen van geïnformeerde toestemming om alle manipulaties uit te voeren, van bloedafgifte tot het voltooien van documentatie, wordt alleen door medisch personeel uitgevoerd. In elk geval ontvankelijk dat één van deze procedures door personeel met biologische, chemische, farmaceutische en andere niet-medische opleiding, gezien de schending van de vastgestelde normen van bio en mensenrechten. Voor positieve test op carrier HBsAg, antilichamen tegen de verwekker van hepatitis C, HIV en syfilis navelstrengbloed niet genomen, en de verzamelde bloedmonsters reeds verwijderd en vernietigd. Opgemerkt dient te worden dat het vervoer van latente infecties bij pasgeborenen is veel zeldzamer dan bij volwassenen, dus de kans op hematogene overdracht en de ontwikkeling van infectieuze complicaties van hematopoietische infusies van navelstrengbloed cellen aanzienlijk lager is dan in het geval van transplantatie van beenmerg van volwassen donoren.

Een belangrijk punt bij de toepassing van navelstrengbloed in de kliniek is de evaluatie van het transplantaat, dat is gebaseerd op de bepaling van het aantal hematopoëtische stamcellen in het navelstrengbloedmonster en de celdoses die nodig zijn voor transplantatie. Normen voor het optimale aantal navelstrengbloedcellen dat nodig is voor transplantatie zijn nog niet ontwikkeld. Er is zelfs geen algemeen aanvaard standpunt met betrekking tot routineparameters zoals het aantal CD34-positieve cellen en CFU-GM. Sommige auteurs evalueerden het vermogen van hematopoïetische cellen door analyse van de lange-termijn kweken met de bepaling van het gehalte kolonievormende eenheden gemeen granulocyten, erythrocyten, monocyten en megakaryocyten - CFU-GEMM.

In klinische omgevingen omvat de standaardevaluatie van navelstrengbloedtransplantatie echter meestal alleen de bepaling van het aantal genucleëerde of mononucleaire cellen.

Opslag van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed

Er zijn enkele problemen in de technologie voor het opslaan van hematopoietische navelstrengbloedcellen. Wanneer de cryopreservatie van hematopoietische stamcellen om hun optimale bevriezing modus moet de hoeveelheid navelstrengbloed en rode bloedcellen eerder verwijderd om hemolyse te voorkomen en het risico op onverenigbaarheid reactie van erytrocyt antigenen (ABO, Rh) minimaliseren bereiken. Voor deze doeleinden zijn verschillende werkwijzen voor het isoleren van genucleëerde cellen geschikt. In de vroege jaren 90 van de vorige eeuw de meest gebruikte methode voor het scheiden kernhoudende cellen in een dichtheidsgradiënt op basis van Ficoll met een dichtheid van 1,077 g / ml of percolatie met een dichtheid van 1,080 g / ml. Scheiding navelstrengbloed door dichtheidsgradiënt laat overwegend mononucleaire cellen te selecteren maar leidt tot aanzienlijke verliezen van hematopoietische progenitorcellen - tot 30-50%.

De sedimentatie-efficiëntie van hydroxyethylzetmeel bij het proces van isolatie van navelstrengbloedcellen wordt op verschillende manieren geschat. Sommige auteurs wijzen op een lage scheidingskwaliteit met behulp van deze methode, terwijl andere onderzoekers integendeel van alle mogelijke methoden de voorkeur geven om HSC-navelstrengbloed precies toe te wijzen met behulp van een 6% oplossing van hydroxyethylzetmeel. Dit benadrukt de hoge efficiëntie van sedimentatie van hemopoietische cellen, die volgens sommige gegevens 84% tot 90% bereikt.

Aanhangers van een ander gezichtspunt dat bijna alle fractioneringsprocessen omvatten grote verliezen yadrosoderzhashih cellen en bieden om scheiding te maken door centrifugeren, afscheiden van het navelstrengbloed in 3 fracties: erytrocyten, leukocyten en plasmaring. Scheiden van de cellen op deze wijze hebben de uitvinders gevonden dat het gehalte van de mononucleaire cellen van vroege hematopoëtische voorlopercellen en cellen met CD34 + immunofenotype uiteindelijk was respectievelijk 90, 88 en 100% van het oorspronkelijke niveau. Soortgelijke hoeveelheden gezuiverde groei van deze wijze van navelstrengbloed cellen verkregen door andere onderzoekers: na bezinking kernhoudende toegewezen 92%, 98% - mononucleaire, 96% - CD34-positieve cellen en 106% kolonievormende eenheden.

Aan het eind van de jaren negentig werd gelatine veel gebruikt als sedimentatiemiddel. In de klinische praktijk, het gebruik van gelatine hematopoietische stamcellen uit navelstrengbloed sinds 1994. Bij gebruik van een 3% -ige oplossing van gelatine, bereikt de efficiëntie van isolatie van genucleëerde cellen 88-94%. Het wijdverbreide gebruik van gelatine bij de ontwikkeling van de navelstrengbloedbank heeft zijn voordelen ten opzichte van andere sedimentatiemiddelen bevestigd. Vergelijkende analyse van alle bovengenoemde werkwijzen voor het isoleren van kern bevattende cellen in termen van hun opeenvolgende toepassing bij iedere beproevingstemperatuur navelstrengbloed toonden dat de optimale bezinkvat-out mononucleaire cellen met het fenotype CD34 + / CD45 +, alsmede het aantal CFU-GM en CFU-GEMM is 3% gelatine oplossing. Het bleek significant minder effectief werkwijzen waarbij Ficoll dichtheidsgradiënt, en het gebruik van methylcellulose en hydroxyethylzetmeel waarin hematopoietische celverlies bereikte 60%.

De uitbreiding van het volume stamceltransplantatie van navelstrengbloed is niet alleen geassocieerd met de ontwikkeling van methoden voor hun productie, maar ook met opslag. Er zijn veel problemen die direct verband houden met de bereiding van navelstrengbloed voor langdurige opslag en de keuze van de optimale cryopreservatietechnologie voor zijn monsters. Onder hen zijn de kwesties van het opportuniteit van het uitvoeren van scheidingsprocedures, het gebruik van verschillende cryopreserverende media en het gebruik van werkwijzen voor het bereiden van ontdooide cellen voor transplantatie. Vervoer van inheemse monsters van navelstrengbloed wordt vaak uitgevoerd vanuit regio's op afstand van hematologische centra. In verband daarmee doet zich het probleem voor van de toegestane perioden voor opslag van navelstrengbloed vanaf het moment van ontvangst ervan tot het begin van cryopreservatie, hetgeen van bijzonder belang is bij de ontwikkeling van navelstrengbloedbanken.

De studie van de functionele activiteit van hematopoietische navelstrengbloed cellen na langdurige opslag (tot 12 jaar) in vloeibare stikstof bleek dat ongeveer 95% van hematopoëtische cellen gedurende deze tijd niet de hoge proliferatieve capaciteit verliezen. Het papier Yurasova S. Et al (1997) toonden aan dat navelstrengbloed opgeslagen bij kamertemperatuur (22 ° C) of bij 4 ° C gedurende 24 en 48 uur niet wezenlijk de levensvatbaarheid van de hematopoietische cellen die het beginniveau op geschikte 92 verminderen en 88%. Als de bewaartijd echter wordt verlengd tot drie dagen, is het aantal levensvatbare genucleëerde cellen in het navelstrengbloed aanzienlijk verminderd. Tegelijkertijd werd tijdens andere onderzoeken gevonden dat bij bewaring gedurende 2-3 dagen bij een temperatuur van 22 of 4 ° C, de levensvatbaarheid van rijpe granulocyten, in plaats van hemopoietische cellen, eerst lijdt.

De levensvatbaarheid van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed kan nadelig worden beïnvloed door systeemcomponenten voor de verzameling. Analyse van het effect van verschillende anticoagulantia, welke werkingsmechanisme door binding van calciumionen (ACD, EDTA, XAPD-1) voor hematopoïetische progenitorcellen in navelstrengbloed bewaaromstandigheden van 24 tot 72 uur, toonde hun negatieve effect op de levensvatbaarheid van cellen met kernen. In dit verband, de auteurs bevelen het gebruik van PBS (fosfaatbufferoplossing) onder toevoeging van natieve heparine zonder conserveermiddel in een concentratie van 20 U / ml, die volgens hen maakt het mogelijk de duur van de opslag ongefractioneerde navelstrengbloed toenemen tot 72 uur en slaat de functionele activiteit van kolonievormende eenheden. In de studie van instandhouding CFU-GM en CFU-G aangetoond dat navelstrengbloed opslagtijd voor cryoconservering mag niet meer dan negen uur. Is duidelijk dat in dit geval moet het beginsel handelen dat als er tegenstrijdige gegevens moeten minimaal aanbevolen navelstrengbloed houdbaarheid gebruiken en start een programmeerbare geïsoleerd bevriezing cellen zo snel mogelijk.

Bij het invriezen van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed, wordt gewoonlijk een 10% -ige oplossing van DMSO als een cryoprotectans gebruikt. Naast het tot expressie gebrachte cryoprotectieve effect heeft dimethylsulfoxide in deze concentratie echter een direct cytotoxisch effect, zelfs onder de voorwaarde van minimale blootstelling aan de bloedvormende cellen van het navelstrengbloed. Om het cytotoxische effect van DMSO te verminderen, worden een temperatuur voor blootstelling aan nul, een toename van de snelheid van alle manipulaties en herhaald wassen na ontdooien van navelstrengmonsters toegepast.

Het Instituut voor Hematologie en Transfusiologie van de Academie voor Medische Wetenschappen van Oekraïne heeft sinds 1995 een wetenschappelijke koers ontwikkeld, waarvan het doel is het navelstrengbloed te bestuderen als een alternatieve bron van hemopoietische stamcellen. In het bijzonder zijn nieuwe technologieën ontwikkeld voor cryopreservatie bij lage temperatuur van hemopoietische cellen van ongefractioneerd en gefractioneerd navelstrengbloed. Als een cryoprotectans wordt medisch polyvinylpyrolidon met een laag molecuulgewicht gebruikt. De methode voor cryopreservatie van niet-gefractioneerd navelstrengbloed is gebaseerd op de oorspronkelijke technologie van pre-preparatie van cellen voor bevriezing en de techniek van speciale behandeling van celsuspensie onmiddellijk voor transplantatie.

Een van de belangrijkste factoren die de mate van functionele activiteit van gecryopreserveerde hemopoietische stamcellen beïnvloeden, is de koelsnelheid van celsuspensie, vooral tijdens de kristallisatiefase. Een softwareaanpak voor het oplossen van het probleem van snelheid en tijd van bevriezen biedt geweldige mogelijkheden voor het creëren van eenvoudige en zeer effectieve methoden voor cryopreservatie, zonder de celsuspensie te wassen voor cryoprotectanten vóór transplantatie.

De stadia van onmiddellijk bevriezen en ontdooien zijn het gevaarlijkst voor de levensvatbaarheid van cellen tijdens hun bereiding. Bij het invriezen van de hemopoietische cellen kan een aanzienlijk deel ervan worden vernietigd op het moment van overgang van het intercellulaire medium van de vloeibare naar de vaste fase - kristallisatie. Om het percentage celdood te verminderen, worden cryoprotectanten gebruikt, waarvan de werkingsmechanismen en de cryoprotectieve effectiviteit adequaat zijn behandeld in de wetenschappelijke literatuur.

Een veelbelovende richting optimalisatie technieken van cryopreservatie van beenmerg en navelstrengbloed cellen te combineren in dezelfde oplossing met lage concentraties van koude beschermende middelen met verschillende werkingsmechanismen, bijvoorbeeld, op het intracellulaire niveau van DMSO en hydroxyethylzetmeel of albumine bezitten extracellulaire omsluitende effect.

Voor cryopreservatie van navelstrengbloed cellen worden traditioneel gebruikt 20% DMSO oplossing die permanent mechanisch roeren in een ijsbad, werd langzaam in de celsuspensie te bereiken gelijk (1: 1) de volumeverhouding celsuspensie en cryoprotectant. De eindconcentratie van dimethylsulfoxide is 10%. De celsuspensie wordt vervolgens afgekoeld op een cryostaat voor software met een snelheid van HS / min tot -40 ° C, waarna de koelsnelheid wordt verhoogd tot 10 ° C / min. Na het bereiken van -100 ° C wordt de houder met de celsuspensie in vloeibare stikstof (-196 ° C) geplaatst. Met deze methode van cryopreservatie bereikt de veiligheid van functioneel actieve mononucleaire cellen na ontdooien 85% van het initiële niveau.

Modificaties van cryoconserveringsmethoden zijn gericht op het verminderen van de concentratie van DMSO door toevoeging van hydroxyethylzetmeel (eindconcentraties van dimethylsulfoxide en hydroxyethylzetmeel zijn respectievelijk 5% en 6%). De hoge efficiëntie van deze combinatie van cryoprotectanten wordt waargenomen wanneer de suspensie van myeloïde cellen wordt bevroren, met niet minder cytoprotectie dan met een enkele 10% oplossing van dimethylsulfoxide. Het aantal levensvatbare genucleëerde cellen bereikte 96,7% van het basislijnniveau en hun functionele activiteit, geschat op basis van het aantal CFU-GM, was 81,8%.

Bij gebruik van dimethylsulfoxide oplossing bij concentraties variërend van 5 tot 10% in combinatie met 4% hydroxyethylzetmeel (eindconcentratie) gevonden dat het behoud van CD34-positieve cellen in deze trajecten dimethylsulfoxide nagenoeg ongewijzigd. Tegelijkertijd onder omstandigheden van verlagen van de concentratie van DMSO 5-2,5% waargenomen massadood navelstrengbloed cellen - aantal levensvatbare celeenheden gereduceerd 85,4-12,2%. Andere auteurs concludeerden dat het 5 tot 10% oplossing van dimethylsulfoxide (in het copyright uitvoeringsvorm - in combinatie met autoloog serum) met maximale efficiëntie cytoprotectie tijdens cryopreservatie van navelstrengbloed HSC. Bovendien grote veiligheid achtereenvolgens ingevroren en ontdooide cellen wordt aangeduid bij combinatie van 5 of 10% DMSO 4% hydroxyethylzetmeel oplossing, in het bijzonder met een geregelde koelsnelheid van TOS / min. In een ander document gebruikt cryoprotectieve oplossing bestaande uit drie ingrediënten reeds - DMSO, gezuiverd menselijk albumine en RPMI medium in een verhouding van 1: 4: 5, waarbij de celsuspensie werd toegevoegd aan een gelijk volume verhoudingen (uiteindelijke DMSO concentratie 5%). Na ontdooien in een waterbad bij een temperatuur van + 4 ° C, overschreed de veiligheid van CFU-GM 94%.

Sommige auteurs suggereren het gebruik van niet-gefractioneerd navelstrengbloed voor cryopreservatie, omdat significante hoeveelheden hematopoietische cellen verloren gaan tijdens de verwijdering van rode bloedcellen. In deze uitvoeringsvorm wordt een 10% oplossing van dimethylsulfoxide gebruikt om mononucleaire cellen te beschermen tegen de schadelijke effecten van cryokristallisatie. Bevriezen wordt uitgevoerd met een constante koelsnelheid van HS / min tot -80 ° C, waarna de suspensie van navelstrengbloedcellen wordt ondergedompeld in vloeibare stikstof. Met deze methode van bevriezen vindt een gedeeltelijke lyse van de erythrocyten plaats, zodat bloedmonsters geen fractionering behoeven. Na ontdooien wordt de celsuspensie gewassen van vrij hemoglobine en dimethylsulfoxide in een oplossing van humaan albumine of in het autologe serum van de patiënt en gebruikt voor transplantatie.

Behoud van hematopoietische stamcellen na het ontdooien niet-gefractioneerde navelstrengbloed inderdaad hoger dan de gefractioneerde, maar in verband met krioustoychivostyu van de rode bloedcellen kan leiden tot ernstige problemen als gevolg van post-transfusie transfusie van ABO-incompatibele rode bloedcellen veroorzaken. Bovendien neemt het volume opgeslagen niet-gefractioneerd bloed aanzienlijk toe. Vanuit een klinisch oogpunt verdient het nog steeds de voorkeur cryopreserve vooraf geïsoleerd en gezuiverd te worden uit andere celfracties van hematopoietische navelstrengbloedcellen.

In het bijzonder, een werkwijze cryopreservatie van navelstrengbloed cellen gefractioneerd zodat erytrocyten te verwijderen als voorbereiding voor het invriezen, hetgeen een 6% oplossing van hydroxyethylzetmeel in het preparaat plazmozameshchath oplossing "Stabizol" gebruikt. Na ontdooien is de aldus verkregen celsuspensie gereed voor klinisch gebruik zonder aanvullende manipulatie.

Op dit moment zijn er veel tamelijk effectieve manieren voor cryopreservatie van navelstrengbloed. Het belangrijkste verschil is dat bloedmonsters tijdens de bereidingsfase en geoogste genucleëerde cellen zonder een mengsel van erytrocyten worden ingevroren of worden onderworpen aan scheiding in celfracties.

Transplantatie van hemopoietische stamcellen van navelstrengbloed

Aan het einde van de jaren 80 - begin jaren 90 van de vorige eeuw werd vastgesteld dat het navelstrengbloed dat de foetus tijdens de zwangerschap verstrekt, wordt gekenmerkt door een hoog gehalte aan hematopoëtische stamcellen. De relatieve eenvoud van het verkrijgen van navelstrengbloedcellen en de afwezigheid van duidelijke ethische problemen stimuleerden het gebruik van navelstrengbloedstamcellen in praktische geneeskunde. De eerste succesvolle transplantatie van navelstrengbloed aan een kind met Fanconi-anemie diende als uitgangspunt voor het uitbreiden van de hoeveelheden navelstrengbloedstamceltransplantatie en het creëren van een systeem voor de bankvoorziening. In het mondiale systeem van navelstrengbloedbanken is het New York Centre for Placental Blood het grootste dat op de balans van de National Institutes of Health staat. Het aantal opgeslagen navelstrengbloedmonsters in deze bank nadert 20 LLC. Het aantal ontvangers (voornamelijk kinderen) groeit ook en succesvolle transplantaties zijn uitgevoerd. Volgens het Amerikaanse ministerie van Volksgezondheid heeft de terugvalvrije periode van leven na transplantatie van ontvangers van HSC-navelstrengbloed al langer dan 10 jaar geleden.

Dit is niet verwonderlijk, aangezien een groot aantal studies van de hematopoietische potentieel van navelstrengbloed is gebleken dat de hoeveelheid en de kwaliteit van de eerste stamcellen niet alleen is niet inferieur aan een humaan beenmerg volwassen, maar ook door een aantal maatregelen te overtreffen. Een grotere proliferatieve potentie van navelstrengbloedstamcellen veroorzaakte ontwikkelingsstoornis cel signaleringsfuncties de aanwezigheid van receptoren op HSCs specifieke groeifactoren het vermogen van navelstrengbloed cellen voor de productie van groeifactoren, de grote omvang en lengte van telomeren autocriene.

Genomische en fenotypische kenmerken van stambloedvormende navelstrengbloedcellen bepalen dus vooraf de kwalitatieve implantatie van een transplantaat met een hoog potentieel voor het herstel van donorhemopoiese in het ontvangende organisme.

Voordelen van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed

Een van de echte voordelen van het gebruik van hematopoietische stamcellen uit navelstrengbloed voor transplantatie ten opzichte van andere bronnen van hematopoietische cellen dient te worden opgemerkt bijna nul risico voor de gezondheid van de donor (indien niet als zodanig een placenta beschouwd), terwijl het elimineren van de noodzaak van algehele anesthesie. Het gebruik van navelstrengbloed verlengt de mogelijkheden van celtransplantatie als gevolg van gedeeltelijk compatibele transplantatie in het HLA-systeem (incompatibiliteit van één tot drie antigenen). De techniek van lange-termijnopslag van hematopoëtische navelstrengbloed cellen in een bevroren toestand, waarin de waarschijnlijkheid van het verkrijgen zeldzame HLA-type verhoogt en zoektijd HLA-gematchte allogene transplantatie. Tegelijkertijd wordt het risico op het ontwikkelen van enkele latente infecties die via de transmissieroute worden overgedragen, aanzienlijk verminderd. Bovendien is er een goedkope vorm van biologische levensverzekering in verband met de mogelijkheid om navelstrengbloedcellen te gebruiken voor autologe transplantatie.

Echter, omdat kleine hoeveelheden bloed die kunnen worden verzameld uit de placenta (gemiddeld niet meer dan 100 ml) op de voorgrond het probleem van het verkrijgen van de maximaal mogelijke hoeveelheid bloed uit de ader van de navelstreng in strikte naleving van de voorwaarden voor minimale kans op bacteriële besmetting van navelstrengbloed afgeleide monsters.

Primitieve hematopoietische cellen uit navelstrengbloed wordt algemeen geïdentificeerd door de aanwezigheid op het oppervlak glikofosfoproteina CD34, en op basis van hun functionele eigenschappen door onderzoek van de klonogene test of kolonievorming in vitro. Vergelijkende analyse toonde aan dat in navelstrengbloed en beenmerg maximumgehalte aan CD34-positieve mononucleaire cellen in de fractie respectievelijk 1,6 en 5,0%, de maximale kolonievormende eenheden in een subpopulatie van CD34 + cellen - 80 tot 25%, totale kloneringsefficiëntie van CD34 + -cellen - 88 en 58%, de maximale kolonievormende cellen met een hoog proliferatief potentieel (HPP-CFC in -populyatsii CD34 +) - 50 en 6,5%. Opgemerkt wordt dat de kloneringsefficiëntie van CD34 + CD38-cellen en het vermogen om te reageren op cytokinestimulatie ook hoger in hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed.

Combinatie fenotypische antigenen Thy-1, CD34 en CD45RA bevestigt de hoge proliferatieve capaciteit van navelstrengbloed hematopoietische cellen en expressie van de drie antigenen op het oppervlak van het navelstrengbloed cellen aangeeft dat ze tot de stamcel. Daarnaast is vastgesteld dat navelstrengbloed cellen bevat met een CD34 + -fenotype die geen lineaire differentiatiemarkers hebben. Het niveau in het navelstrengbloed van celsubpopulaties met het fenotypische profiel van CD34 + / Lin is ongeveer 1% van het totale aantal CD34-positieve cellen. Voorlopercellen van hematopoïetische navelstrengbloed produceren zowel de lymfoïde cellijn als de polypotente myeloïde reeks van lineaire celdifferentiatie, die ook aangeeft dat ze behoren tot stamcellen.

Zoals gezegd is het wezenlijke verschil tussen het beenmerg en navelstrengbloed in een hoeveelheid verkregen door één bemonsteringsprocedure voor transplantatie van hematopoëtische cellen. Bij beenmergtransplantatie verlies van celmassa in het scheidingsproces, cryopreservatie, ontdooien en testen zijn toegestaan in het traject van 40-50%, het navelstrengbloed cellen dergelijk verlies is zeer belangrijk, omdat door het gebruik onvoldoende aantal HSC transplantaat onhoudbaar. Volgens G. Kogler et al (1998) celtransplantatie bij de ontvanger lichaamsgewicht van 10 kg potentiële transplantatie (totaal aantal verzamelde navelstrengbloed - 2098) kunnen alle navelstrengbloed, lichaamsgewicht 35 kg - 67%, en slechts 25% van de monsters kan een effectieve transplantatie bieden bij patiënten met een lichaamsgewicht van 50-70 kg. Deze klinische situatie duidt op de noodzaak om de effectiviteit van bestaande methoden voor bemonstering, reproductie en opslag van navelstrengbloedcellen te optimaliseren en te verbeteren. Daarom is de kwestie van standaardisatie van bemonsteringsmethoden, testen, scheiding en cryopreservatie van navelstrengbloed nu uitvoerig besproken in de literatuur voor het creëren van bloedbanken, het gebruik ervan in de kliniek, en vaststelling van de voorwaarden en condities van opslag van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed.

[11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]

Het gebruik van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed in de geneeskunde

Meestal kunnen tot 10 ⁶ hematopoietische stamcellen worden geïsoleerd uit navelstrengbloed , zelden meer. In verband hiermee is de vraag tot op heden nog steeds de toereikendheid van zoveel hematopoietische navelstrengbloedcellen om de hematopoëse van de volwassen ontvanger te herstellen. De meningen over dit onderwerp waren verdeeld. Sommige onderzoekers zijn van mening dat deze hoeveelheid voldoende voor transplantatie kinderen, maar te klein om volwassen mens, waarvoor de toediening optimale transplanteren (10/07) x 10 ⁶ CD34-positieve cellen per 1 kg lichaamsgewicht - gemiddeld 7 x 10 ⁸ per transplantatie. Uit deze berekeningen volgt dat één navelstrengmonster 700 maal minder hematopoëtische stamcellen bevat dan nodig is voor één transplantatie bij een volwassen patiënt. Een dergelijke kwantitatieve beoordeling wordt echter gemaakt naar analogie van het aantal getransfundeerde cellen in het beenmerg en negeert volledig de ontogenetische kenmerken van hematopoëse.

In het bijzonder wordt het feit van een hoger proliferatief potentieel van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed genegeerd in vergelijking met hemopoietische voorlopercellen van het beenmerg. De resultaten van studies naar het kolonievormend vermogen in vitro suggereren dat één dosis navelstrengbloed een reconstructie van de hematopoëse van de volwassen ontvanger kan geven. Aan de andere kant moeten we niet vergeten dat het aantal HSCs afneemt, zelfs in het proces van de embryonale ontwikkeling: de inhoud van CD34-positieve cellen in het navelstrengbloed wordt 5 keer lineair verlaagd in een periode van 20 weken (bloed voor de studie werd verkregen in het geval van voortijdige beëindiging van de zwangerschap) tot 40 weken zwangerschap (de periode van fysiologische geboorten), die gepaard gaat met een parallelle, permanente toename van de expressie van lineaire cytodifferentiatiemarkers.

Vanwege het ontbreken van een gestandaardiseerde benadering van de kwantificatie van voorlopercellen in navelstrengbloedmonsters, gaat de controverse over de optimale dosis bloedcellen van hematopoëtisch bloed door. Sommige onderzoekers zijn van mening dat als de criteria selectie van navelstrengbloed monsters het aantal cellen met kernen en mononucleaire cellen kunnen worden gebruikt, het herberekenen van het lichaamsgewicht van de ontvanger, dat wil zeggen de dosis. Sommige auteurs zijn van mening dat de minimale kwantificering drempel van CD34 + cellen, zelfs voor autotransplantatie GCW is 2 x 10 ⁶ / kg. De verhoging van de dosis van hematopoietische cellen tot 5 x 10 ⁶ cellen / kg (in totaal 2,5) levert reeds een geschikter voor de vroege post transplantatie, vermindert de incidentie van infectieuze complicaties en verkort de tijd van preventieve antibiotica.

Volgens E. Gluckman c.s. (1998) in hematologie voor een succesvolle transplantatie van navelstrengbloed cellen is het inbrengen van ten minste 3,7 x 10 ⁷ cellen met kernen per 1 kg lichaamsgewicht van de ontvanger. Met een daling van de dosis hematopoietische stamcellen tot 1 x 10 ⁷ en minder genucleëerde cellen per 1 kg lichaamsgewicht, is het risico van transplantaatfalen en herhaling van kanker sterk toegenomen. Er moet worden onderkend dat het minimale aantal voorlopercellen dat nodig is voor het snelle herstel van hemopoëse na GSG-allotransplantatie nog niet bekend is. In theorie kan dit worden bereikt door een enkele cel, maar klinische beenmergtransplantatie snelle en stabiele enting gewaarborgd transfusie minimaal (1-3) x 10 ⁸ cellen met kernen per 1 kg lichaamsgewicht van de patiënt.

Een recente gedetailleerde studie om de optimale hoeveelheid HSC in de oncohematologie te bepalen, omvatte de observatie van patiënten van drie geïsoleerde groepen afhankelijk van het gehalte aan CD34-positieve cellen in het transplantatiemateriaal. Patiënten werden de eerste groep (3-5) toegediend x 10 ⁶ cellen / kg. GSK dosering bij patiënten van de tweede groep bedroeg (10/05) x 10 ⁶ cellen / kg en de derde groep patiënten getransplanteerd meer dan 10 x 10 ⁶ CD34 + cellen / kg. De beste resultaten werden waargenomen in de groep ontvangers behandeld met het transplantaat aantal CD34-positieve cellen waren gelijk aan (5/3) x 10 ⁶ / kg. Bij toenemende doses van getransplanteerde cellen dan 5 x 10 ⁶ / kg statistisch significante voordelen geïdentificeerd. Aldus zeer hoog gehalte HSCs in het transplantaat (> 10 x 10 x ⁶ / kg) werd geassocieerd met een significante hoeveelheid resterende herinfusie van tumorcellen, waardoor terugval van de ziekte. Er was geen directe relatie tussen het aantal getransplanteerde allogene voorlopercellen en de ontwikkeling van de "graft-versus-host" -reactie.

De geaccumuleerde wereldervaring van transplantatie van HSC-navelstrengbloed bevestigt hun hoge potentiële repopulatie. De engraftment-snelheid van de navelstrengbloedtransplantatie correleert met het aantal ingebrachte kernbevattende cellen. De beste resultaten worden waargenomen bij een transplantatie van 3 × 10 ⁷ / kg, terwijl voor het beenmerg deze dosis 2 × 10 ⁸ / kg is. Volgens de gegevens van de coördinatiecentra werden eind 2000 1200 transplantaties van navelstrengbloedcellen gemaakt in de wereld, voornamelijk van donorfamilies (83%). Vanzelfsprekend moet navelstrengbloed worden beschouwd als een alternatief voor het beenmerg voor transplantatie aan patiënten met hemoblastoses.

Echter, neonatale aard Cordova bron van hematopoietische weefsel aan te moedigen door de aanwezigheid van de functionele kenmerken van zijn GCW. Echter, slechts klinische ervaring een antwoord op de vraag van de geschiktheid van een monster van navelstrengbloed voor volwassen hematopoietische reconstructie van de ontvanger met aplasie van hematopoiese geven. Transplantatie van navelstrengbloed cellen wordt gebruikt bij de behandeling van veel ziekten van de tumor en niet-tumor aard: leukemie en myelodysplastische syndromen, non-Hodgkin-lymfoom, en neuroblastoom, aplastische anemie, aangeboren Fanconi anemie en Diamond Black fan, tekort aan leukocytenadhesie, Barr syndroom, Gunther ziekte Harlera syndroom, thalassemie .

Veel aandacht en afzonderlijk onderzoek verdienen de immunologische aspecten van transplantatie van bloedvormende cellen van het navelstrengbloed. Er wordt aangetoond dat bij transplantatie van stamcellen uit navelstrengbloed van donoren met onvolledige HLA-gematchte transplantatie resultaten zijn zeer bevredigend, dat volgens de auteurs, hetgeen een lagere immunoreactiviteit navelstrengbloed dan beenmerg.

Een gedetailleerde studie van de cellulaire samenstelling van navelstrengbloed toonde kenmerken van zowel fenotypisch spectrum van effectorcellen van het immuunsysteem en hun functionele activiteit, waardoor navelstrengbloed beschouwen als een bron van HSC's met een relatief laag risico op reactie "graft versus host". Onder de tekenen van functionele onrijpheid van immunocompetente navelstrengbloedcellen, moet men een onevenwichtigheid in cytokineproductie en een afname in gevoeligheid voor de cytokinebepaling van de immuunrespons opmerken. De resulterende remming van cytotoxische lymfocytactiviteit wordt beschouwd als een factor die bijdraagt aan de vorming van immunologische tolerantie voor het getransplanteerde hemopoietische weefsel. In de navelstrengbloed lymfocytenpopulatie overheersen, in tegenstelling tot perifeer bloed en beenmerg van volwassen donoren, inactieve, onrijpe lymfocyten en suppressorcellen. Dit duidt op een verminderde beschikbaarheid van navelstrengbloed-T-lymfocyten voor de immuunrespons. Een belangrijk kenmerk van de monocytpopulatie van navelstrengbloedcellen is het lage gehalte aan functioneel complete en actieve antigeenpresenterende cellen.

Aan de ene kant, een lage mate van volwassenheid van effector cellen van het immuunsysteem in het navelstrengbloed lezingen strekt zich uit tot het gebruik ervan in de kliniek, omdat deze functies kan de vermindering van de intensiteit van het immuunsysteem conflict tussen donor en ontvanger cellen. Maar aan de andere kant weten we van het bestaan van een correlatie tussen de mate van reactie "graft versus host disease" en transplantatie antitumoreffect, dat wil zeggen, het effect van de ontwikkeling van "graft-versus-leukemie". In verband hiermee is een studie uitgevoerd naar de antitumorale cytotoxiciteit van navelstrengbloedcellen. De resultaten geven aan dat, ondanks de echt verzwakte immuunrespons van navelstrengbloed cellen antigene stimulatie, geactiveerd in de eerste plaats zijn de natural killer cellen en killeropodobnymi cellen die actief betrokken zijn bij de mechanismen van de uitvoering van de anti-tumor cytotoxiciteit. Bovendien is in navelstrengbloed lymfocyt subpopulaties werden gevonden met het fenotype CD16 + CD56 + en CD16 "TCRA / p +. Aangenomen wordt dat deze cellen in een geactiveerde vorm implementeren reactie" graft-versus-leukemie".

Aan het Instituut voor Oncologie, Academie van Medische Wetenschappen van Oekraïne werden gecryopreserveerd hematopoietische cellen uit navelstrengbloed toegediend aan kankerpatiënten met hardnekkige hypoplasie van hematopoëse als gevolg van chemotherapie en radiotherapie. Bij deze patiënten, transplantatie van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed effectief hersteld bloed onderdrukking, zoals blijkt uit aanhoudende verhoging van rijpe gevormde elementen in het perifere bloed, evenals een toename van indicatoren karakteriseren van de toestand van cellulaire en humorale immuniteit. Stabiliteit van het herbevolkingseffect na transplantatie van bloedvormende cellen van navelstrengbloed maakt voortdurende bestraling en chemotherapie mogelijk zonder het verloop van de behandeling te onderbreken. Er is bewijs van een grotere efficiëntie allograft stamcellen uit navelstrengbloed kankerpatiënten: de jaarlijkse risico van herhaling van een tumor in het gebruik ervan was 25% versus 40% bij patiënten die getransplanteerde allogene beenmerg gen.

Het werkingsmechanisme van gecryopreserveerde navelstrengbloedstamcellen worden beschouwd als het resultaat van een humorale stimulering van hematopoiese ontvangers veroorzaakt door het unieke vermogen van neonatale cellen om de productie van hematopoietische groeifactoren autocriene, en als gevolg van de tijdelijke implantatie van donorcellen (als bevestiging - een aanzienlijke toename van het gehalte van perifeer bloed foetaalhemoglobine ontvanger 7-15 e dag na transfusie ten opzichte van baseline). Afwezigheid bij ontvangers van navelstrengbloed na transfusie reacties - gevolg van de relatieve tolerantie van immuuncellen, evenals het vertrouwen criterium bruikbaarheid van gecryopreserveerde biologisch materiaal.

Progenitorcellen T lymfocyten killer navelstrengbloed activeerbaar onder invloed van exogene cytokine stimulatie die wordt gebruikt om nieuwe ex vivo en in vivo werkwijzen voor het induceren van antitumor cytotoxische lymfoïde cellen voor latere transplantatie immunotherapie te ontwikkelen. Bovendien maakt de "onvolgroeidheid" van het genoom van immunocompetente navelstrengbloedcellen het mogelijk dat ze worden gebruikt om antitumoractiviteit te versterken door moleculaire modelleringswerkwijzen.

Tegenwoordig heeft navelstrengbloed een brede toepassing gevonden, voornamelijk in pediatrische hematologie. Bij kinderen met acute leukemie allotransplantatie van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed in vergelijking met allogene beenmerg, vermindert de incidentie van reactie "graft versus host". Er is echter een langere periode van neutropenie en trombocytopenie en, helaas, een hoger niveau van 100 dagen post-transplantatie mortaliteit. Een langere herstelperiode in het perifere bloed granulocyten en bloedplaatjes kan worden veroorzaakt door onvoldoende differentiatie van afzonderlijke subpopulaties van CD34 positieve cellen van navelstrengbloed, zoals blijkt uit het lage niveau van de opname van radioactief rhodamine en lage expressie van CD38 antigenen op hun oppervlak.

Op hetzelfde moment, de transplantatie van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed van volwassen patiënten, uitgevoerd door een gebrek aan zowel een compatibele niet-verwante beenmerg donor, evenals mogelijkheden om autologe HSC mobiliseren toonde hoge jaarlijkse recidief-vrije overleving bij patiënten jonger dan 30 jaar (73%) . Uitbreiding van het leeftijdsbereik van ontvangers (18-46 jaar) resulteerde in een afname van het overlevingspercentage tot 53%.

Kwantitatieve analyse van cellen met het fenotype CD34 + beenmerg en navelstrengbloed toonde hoger (3,5 keer) de inhoud in het beenmerg, maar navelstrengbloed vertoonden een significante overwicht van cellen met fenotypische profiel van CD34 + HLA-DR .Izvestno, chtokletkikrovisimmunologicheskimi CD34 + HLA-DR prolifereren actiever dan immunofenotype cellen met CD34 + HLA-DR +, zoals bevestigd in experimentele studies van de groei op lange termijn kweek van hematopoëtische cellen in vitro. Primitieve cel voorlopers met het fenotype CD34 + CD38 in navelstrengbloed en beenmerg, maar navelstrengbloed cellen met het stellen CD34 + CD38 marker hebben hogere klonogene activiteit dan hematopoietische cellen van hetzelfde fenotype, geïsoleerd uit volwassen donor beenmerg. Daarnaast zal navelstrengbloed cellen met CD34 + CD38 immunofenotype prolifereren in respons op stimulatie met cytokines (IL-3, IL-6, G-CSF) en reproduceren 7 keer meer kolonies op lange termijn kweken dan beenmergcellen.

Banken van stamcellen van navelstrengbloed

Voor een goede ontwikkeling van het nieuwe gebied van praktische geneeskunde - transplantatie van stamcellen uit navelstrengbloed, evenals transplantaties van hematopoietische stamcellen uit het beenmerg uit te voeren, moet u een uitgebreid netwerk van bloedbanken, die al in de VS en Europa zijn gevestigd. De intrastatelijke netwerken van navelstrengbloedbanken zijn verenigd door de Association of Netcord Banks. De haalbaarheid van een internationale vereniging van navelstrengbloed banken wordt bepaald doordat uitvoeren ongerelateerde transplantaties moet een groot aantal monsters van navelstrengbloed getypt, waardoor de HLA-identieke donor kiezen. Alleen de oprichting van een systeem van banken met de opslag van bloedmonsters van verschillende HLA-typen erin, kan het probleem van het vinden van de noodzakelijke donor echt oplossen. De organisatie van een dergelijk systeem van navelstrengbloedbanken vereist de inleidende ontwikkeling van ethische en wettelijke normen, die momenteel op internationaal niveau worden besproken.

Om navelstrengbloedbanken in Oekraïne te maken, is het noodzakelijk om een aantal bepalingen en documenten uit te werken.

Allereerst zijn dit vragen over het standaardiseren van de methoden voor bemonstering, fractionering en bevriezing van navelstrengbloed. Het is noodzakelijk om het navelstrengbloed verzameling regels te reguleren in ziekenhuizen, in overeenstemming met de eisen van de medische ethiek, het minimumbedrag van navelstrengbloed, die een succesvolle transplantatie biedt bepalen. Er dient te worden vergeleken en standaardisering van verschillende criteria van de evaluatie van de kwaliteit en het aantal hematopoietische stamcellen evenals HLA-typering methoden en methoden voor de diagnose van genetische en besmettelijke ziekten die door de infusie van navelstrengbloed cellen kunnen worden overgedragen ingesteld algemene selectiecriteria gezonde donoren. Het is ook de moeite waard om de creatie van afzonderlijke opslagfaciliteiten voor serum, cellen en DNA afkomstig van navelstrengbloed te bespreken.

Het is absoluut noodzakelijk om een computernetwerk van gegevens over navelstrengbloed te organiseren voor de implementatie van de relatie met de registers van beenmergdonoren. Om de celtransplantologie verder te ontwikkelen, moeten speciale protocollen worden ontwikkeld voor het vergelijken van de resultaten van navelstrengbloed en beenmergtransplantatie van HLA-identieke familieleden en niet-verwante donors. In de oplossing van ethische en juridische problemen van de klinische toepassing van navelstrengbloedcellen, kan de standaardisatie van documentatie, waaronder geïnformeerde toestemming van de ouders, en kennisgeving van de moeder of verwanten over de genetische en / of infectieziekten van het kind, helpen.

De bepalende voorwaarde voor de ontwikkeling van celtransplantatie in Oekraïne zal de goedkeuring van het nationale programma voor de donatie van stamcellen en de ontwikkeling van internationale samenwerking met andere landen door de World Association of donor beenmerg (WMDA), de Nationale VS donorbeenmerg programma (NMDP) en andere registers.

Generaliseren nog korte geschiedenis van hematopoietische stamceltransplantatie van navelstrengbloed, stellen we vast dat de eerste aanname van de mogelijkheid van klinische toepassing van navelstrengbloed, gemaakt in de vroege jaren 70, in de 80 jaar werden bevestigd de resultaten van experimentele studies bij dieren, en in 1988 jaar is uitgevoerd 's werelds eerste transplantatie van hematopoietische cellen van menselijke navelstrengbloed, en begon toen tot een wereldwijd netwerk van navelstrengbloed banken te ontwikkelen. Na 10 jaar is het aantal patiënten met getransplanteerde hematopoietische cellen, navelstrengbloed dichter bij 800. Hiervan waren patiënten met verschillende tumorziekten (leukemie, lymfoom, vaste tumoren) en non-tumor (aangeboren immuundeficiëntie, anemie, ziekten geassocieerd met metabolische stoornissen) aard.

In navelstrengbloed is het gehalte aan vroege en geëngageerde celvoorlopers hoger dan in het perifere bloed van een volwassene. Door het aantal kolonievormende eenheden van granulocyt-macrofagen en hun proliferatieve potentiaal, overschrijdt navelstrengbloed het perifere bloed van volwassenen zelfs na de introductie van groeifactoren aanzienlijk. In celculturen op lange termijn in vitro was er een grotere proliferatieve activiteit en levensvatbaarheid van navelstrengbloedcellen dan beenmergcellen. De kritische momenten in de transplantatie van navelstrengbloed stamcellen zijn hematopoietische potentiële aantal kern bevattende cellen en de aanwezigheid van cytomegalovirus, HLA- compatibele donor en ontvanger, lichaamsgewicht en leeftijd van de patiënt.

Niettemin moet stamceltransplantatie van navelstrengbloed worden beschouwd als een alternatief voor beenmergtransplantatie om ernstige bloedziekten te behandelen, vooral bij kinderen. Klinische problemen van transplantatie van navelstrengbloed cellen geleidelijk opgelost - er al heel efficiënt bemonsteringstechnieken, scheiding en cryopreservatie van navelstrengbloed cellen indien aan de voorwaarden voor de vorming van navelstrengbloed banken zijn de testmethoden verbeterde kernhoudende cellen. Optimale scheiding tijdens grootschalige voorvorm navelstrengbloed hematopoietische stamcellen in de inrichting van banken moet worden beschouwd als een 3% oplossing van gelatine en 6% hydroxyethylzetmeel oplossing.

Perehrestenko P. Et al (2001) terecht op dat transplantatie van stamcellen uit navelstrengbloed zijn juiste plaats in het complex therapeutische maatregelen moet nemen om het indrukken van hematopoiese van verschillende oorsprong te overwinnen, zoals GSK navelstrengbloed verschillen op een aantal belangrijke voordelen, waaronder belang is het relatieve gemak van oogsten, geen risico voor de donor, weinig contaminatie van neonatale cellen door virussen en relatief lage transplantatiekosten. Sommige auteurs suggereren dat de transplantatie van navelstrengbloed cellen minder vaak dan beenmergcellen gaat gepaard met complicaties bij de omzetting van "graft versus host", die het gevolg is volgens hen een zwakke expressie in het navelstrengbloed cellen of HLA-DR antigenen en hun onvolwassenheid. Niettemin is de belangrijkste populatie van kern bevattende cellen van navelstrengbloed zijn T-lymfocyten (SDZ-positieve cellen), waarvan het gehalte ongeveer 50%, hetgeen 20% lager dan in het perifere bloed van een volwassen, maar de fenotypische verschillen van subpopulaties van T-cellen van deze bronnen zijn onbeduidend.

Een van de factoren die de overleving van stamceltransplantatie van navelstrengbloed rechtstreeks van invloed zijn, moeten we er rekening mee de leeftijd van de patiënten (de beste resultaten zijn te zien in de ontvangers tot 5 jaar), een vroege diagnose van de ziekte en een vorm van leukemie (efficiëntie is significant hoger in acute leukemie). Van groot belang zijn de dosis genucleëerde navelstrengbloedcellen, evenals hun HLA-compatibiliteit met de ontvanger. Het is geen toeval analyse van de klinische werkzaamheid van navelstrengbloed transplantatie GSK in Oncologie en Hematologie geeft de beste resultaten van de behandeling met behulp van gerelateerde transplantaties: één-jaars ziektevrije overleving in dit geval 63% bereikt, terwijl de niet-verwante transplantatie - slechts 29%.

De aanwezigheid van een groot aantal stamcellen in navelstrengbloed en hoge repopulyatsionnaya vermogen neonatale hematopoietische stamcellen maakt ze geschikt voor allogene transplantatie bij patiënten met hematologische maligniteiten. Merk echter op dat de herhaling van hematopoiese na transplantatie van hematopoietische stamcellen van navelstrengbloed "wordt gerekt in time": herstel gehalte in perifeer bloed neutrofielen komt meestal tegen het einde van de 6 weken en trombocytopenie fenomeen verdwijnen, meestal na 6 maanden. Ernstig verloop van acute en chronische reactie "graft versus host" respectievelijk waargenomen in 23 en 25% van de ontvangers: Bovendien is de onrijpe bloedvormende cellen van navelstrengbloed niet immunologisch conflict uitgesloten. Recidieven van acute leukemie tegen het einde van het eerste jaar na transplantatie van navelstrengbloedcellen worden in 26% van de gevallen opgemerkt.

[18], [19], [20], [21]