De rol van kristalafzettingen in de pathogenese van artrose

Basisch calciumfosfaat (BCP)-kristallen worden aangetroffen in de synoviale vloeistof van 30-60% van de patiënten met artrose. Volgens A. Swan et al. (1994) worden calciumhoudende kristallen aangetroffen in de synoviale vloeistof van een veel groter aantal patiënten met artrose; vanwege de extreem kleine omvang van de kristallen of hun geringe aantal worden ze echter niet geïdentificeerd met conventionele technieken. De aanwezigheid van BCP-kristallen in de synoviale vloeistof correleert met radiografische tekenen van degeneratie van gewrichtskraakbeen en wordt geassocieerd met een groter effusievolume vergeleken met effusie in kniegewrichten zonder kristallen. Een onderzoek naar factoren die de radiografische progressie van gonartrose beïnvloeden, toonde aan dat de afzetting van calciumpyrofosfaatdihydraat (CPPD)-kristallen een voorspeller is van een ongunstige klinische en radiografische uitkomst. In een onderzoek bij oudere patiënten bleek artrose geassocieerd te zijn met chondrocalcinose, met name in het laterale tibiofemorale compartiment van de knie en de eerste drie metacarpofalangeale gewrichten. Het is niet ongebruikelijk dat beide typen kristallen, OFC en PFC, worden aangetroffen bij patiënten met artrose.

Klinisch gezien verschilt degeneratie van gewrichtskraakbeen veroorzaakt door calciumkristalafzetting van die bij primaire artrose. Als kristallen een eenvoudig epifenomeen van kraakbeendegeneratie zouden zijn, zouden ze worden aangetroffen in de gewrichten die het vaakst worden aangetast door primaire artrose, namelijk de knieën, heupen en kleine handgewrichten. Daarentegen treffen ziekten met kristalafzetting meestal gewrichten die niet typisch zijn voor primaire artrose, zoals de schouder, pols en elleboog. De aanwezigheid van kristallen in het gewrichtsvocht (effusie) wordt geassocieerd met ernstigere degeneratie van gewrichtskraakbeen. De vraag wat de oorzaak is en wat het gevolg, kristalafzetting of kraakbeendegeneratie, is onderwerp van discussie. Een tussenpositie wordt ingenomen door de volgende aanname: een primaire afwijking in het kraakbeenmetabolisme leidt tot degeneratie, en secundaire afzetting van kristallen versnelt de afbraak ervan (de zogenaamde amplificatielustheorie).

Het exacte mechanisme waarmee calciumkristallen gewrichtskraakbeen beschadigen, is onbekend en wordt hieronder samengevat. Theoretisch gezien kunnen calciumkristallen chondrocyten direct beschadigen. Histologisch onderzoek toont echter zelden kristallen in de buurt van chondrocyten aan, en nog zeldzamer worden ze door chondrocyten opgenomen. Het meest waarschijnlijke mechanisme is fagocytose van kristallen door cellen van de synoviale bekleding, gevolgd door de afgifte van proteolytische enzymen of secretie van cytokinen die de afgifte van enzymen door chondrocyten stimuleren. Dit concept wordt ondersteund door een studie naar de rol van PFKD-geïnduceerde synovitis bij de ontwikkeling van snel progressieve artrose bij pyrofosfaatartropathie. In deze studie werden calciumpyrofosfaatdihydraatkristallen (1 of 10 mg) wekelijks geïnjecteerd in de rechterknie van konijnen met artrose geïnduceerd door partiële laterale meniscectomie. Het bleek dat na 8 injecties het rechterkniegewricht significant ernstigere veranderingen vertoonde dan het linker. De intensiteit van synoviale ontsteking correleerde met intra-articulaire injecties met calciumpyrofosfaatdihydraatkristallen en de dosering ervan. Ondanks het feit dat de in deze studie gebruikte doseringen CPPD-kristallen de in vivo doseringen overtreffen, wijzen de resultaten op de rol van CPPD-geïnduceerde ontsteking in de progressie van artrose bij pyrofosfaatartropathie.

Mogelijke mechanismen voor de inductie van schade aan het gewrichtskraakbeen door calciumhoudende kristallen houden verband met hun mitogene eigenschappen, het vermogen om MMP's te induceren en de prostaglandinesynthese te stimuleren.

Mitogene werking van calciumhoudende kristallen. Bij kristalgeassocieerde artropathieën wordt vaak proliferatie van cellen in de synoviale bekleding waargenomen, waarbij de kristallen zelf slechts gedeeltelijk verantwoordelijk zijn voor dit proces. De toename van het aantal synoviale cellen gaat gepaard met een verhoogde secretie van cytokinen, die chondrolyse bevorderen en de secretie van proteolytische enzymen induceren. OFC-kristallen in concentraties die worden aangetroffen bij humane gewrichtspathologie stimuleren dosisafhankelijk de mitogenese van rustende huidfibroblastculturen en synoviale fibroblasten bij honden en muizen. Kristallen van calciumpyrofosfaatdihydraat, uraat, sulfaat, carbonaat en calciumfosfaat stimuleren de celgroei. De aanvang en piek van de ( ^3H )-thymidine-incorporatie die door deze kristallen wordt geïnduceerd, worden met 3 uur verschoven in vergelijking met de stimulatie van cellen met bloedserum. Deze tijdsperiode kan noodzakelijk zijn voor fagocytose en het oplossen van kristallen. Toevoeging van controlekristallen van dezelfde grootte (bijv. diamantstof of latexdeeltjes) stimuleerde de mitogenese niet. Kristallen van natriumuraatmonohydraat hadden zwakke mitogene eigenschappen en waren significant inferieur aan die van calciumuraat, wat wijst op het belang van het calciumgehalte van de kristallen in de mitogenese. Synthetische OFC-kristallen hadden dezelfde mitogene eigenschappen als kristallen verkregen van patiënten met chondrocalcinose. Het mitogene effect van calciumhoudende kristallen was niet het resultaat van een toename van het calciumgehalte van het omringende voedingsmedium in vitro, aangezien het oplossen van basische calciumfosfaatkristallen in het voedingsmedium de opname van ( ^3H )-thymidine door fibroblasten niet stimuleerde.

Eén voorgesteld mechanisme voor OFC-geïnduceerde mitogenese is dat abnormale synoviale celproliferatie, ten minste gedeeltelijk, te wijten kan zijn aan endocytose en intracellulaire oplossing van kristallen, wat de cytoplasmatische Ca ²⁺ -concentraties verhoogt en de calciumafhankelijke route activeert die leidt tot mitogenese. Dit concept wordt ondersteund door de noodzaak van direct cel-kristalcontact om mitogenese te stimuleren, aangezien blootstelling van celculturen aan kristallen celgroei induceerde, terwijl blootstelling van cellen zonder dergelijk contact dat niet deed. Om de noodzaak van kristalfagocytose na cel-kristalinteractie te bestuderen, werden cellen gekweekt met ⁴⁵ Ca-OPC en ( ³ H)-thymidine. Er werd vastgesteld dat cellen met ⁴⁵ Ca-OPC significant meer ( ³ H)-thymidine incorporeerden dan cellen zonder basische calciumfosfaatlabeling. In macrofaagculturen resulteerde remming van kristalendocytose door cytochalasine in remming van kristaloplossing, wat de noodzaak van fagocytose verder onderstreept.

Calciumhoudende kristallen zijn oplosbaar in zuur. Na fagocytose lossen de kristallen op in de zure omgeving van macrofaagfagolysosomen. Chloroquine, ammoniumchloride, bafilomycine A1 en alle lysosomotrofe middelen die de lysosomale pH dosisafhankelijk verhogen, remmen de intracellulaire kristaloplossing en de opname van (3H)-thymidine ⁱⁿ fibroblasten gekweekt met basische calciumfosfaatkristallen.

Toevoeging van OFC-kristallen aan een monolaag fibroblastkweek veroorzaakte een onmiddellijke tienvoudige toename van intracellulair calcium, dat na 8 minuten terugkeerde naar de uitgangswaarde. De calciumbron bestond voornamelijk uit extracellulaire ionen, aangezien de basische calciumfosfaatkristallen werden toegevoegd aan een calciumvrij kweekmedium. De volgende toename van de intracellulaire calciumconcentratie werd na 60 minuten waargenomen en hield minstens 3 uur aan. De calciumbron bestond hier uit gefagocyteerde kristallen opgelost in fagolysosomen.

Er werd vastgesteld dat het mitogene effect van OFC-kristallen vergelijkbaar is met dat van PDGF als groeifactor; net als PDGF vertonen OFC-kristallen synergisme met IGF-1 en bloedplasma. Blokkering van IGF-1 vermindert de celmitogenese als reactie op OFC. PG Mitchell et al. (1989) toonden aan dat inductie van mitogenese in Balb/c- ₃ T3-fibroblasten _door OFC-kristallen de aanwezigheid vereist van serine/threonine-proteïnekinase C (PKC), een van de belangrijkste mediatoren van signalen die worden gegenereerd tijdens externe stimulatie van cellen met hormonen, neurotransmitters en groeifactoren. Een afname van de PKC-activiteit in Balb/c-3 T3-cellen _{remt de doorOFC} gemedieerde inductie van de proto-oncogenen c-fos en c-myc, maar heeft geen invloed op de door PDGF gemedieerde stimulatie van deze oncogenen.

De toename van intracellulair calcium na het oplossen van gefagocyteerde kristallen is niet de enige signaalroute voor mitogenese. Wanneer groeifactoren zoals PDGF zich binden aan hun membraanreceptor, wordt fosfolipase C (een fosfodiësterase) gestimuleerd, die fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat hydrolyseert tot de intracellulaire boodschappers inositol-3-fosfaat en diacylglycerol. Diacylglycerol maakt calcium vrij uit het endoplasmatisch reticulum door de activiteit van calciumafhankelijke en calcium/calmoduline-afhankelijke enzymen zoals proteïnekinasen en proteasen te moduleren.

R. Rothenberg en H. Cheung (1988) rapporteerden een verhoogde afbraak van fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat door fosfolipase C in synoviale cellen van konijnen als reactie op stimulatie met OFC-kristallen. Deze laatste verhoogde het gehalte aan inositol-1-fosfaat in cellen met gelabeld ( ^3H )-inositol significant; de piek werd binnen 1 minuut bereikt en hield ongeveer 1 uur aan.

Diacylglycerol is een potentiële activator van calciumpyrofosfaatdihydraat. Omdat OFC-kristallen de activiteit van fosfolipase C verhogen, wat leidt tot accumulatie van diacylglycerol, kan men bijgevolg een toename van PKC-activering verwachten. PG Mitchell et al. (1989) vergeleken de effecten van OFC-kristallen en PDGF op de DNA-synthese door Balb/c- _{3T3-fibroblasten}. In celkweek werd PKC geïnactiveerd door incubatie van cellen met tumorondersteunende forboldiester (TPD), een diacylglycerolanaloog. Langdurige stimulatie met lage doses TPD verminderde de PKC-activiteit, terwijl een enkele stimulatie met een hoge dosis deze activeerde. Stimulatie van de DNA-synthese door OFC-kristallen werd onderdrukt na PKC-inactivering, wat het belang van dit enzym in OFC-geïnduceerde mitogenese aangeeft. Eerder hebben GM McCarthy et al. (1987) toonden een verband aan tussen de mitogene respons van menselijke fibroblasten op OFC-kristallen en PKC-activering. OFC-kristallen activeren echter geen fosfatidylinositol-3-kinase of tyrosinekinases, wat bevestigt dat het mechanisme van celactivering door OFC-kristallen selectief is.

Celproliferatie wordt gereguleerd door een groep genen genaamd proto-oncogenen. De eiwitten foe en mye, producten van de proto-oncogenen c-fos en c-myc, zijn gelokaliseerd in de celkern en gebonden aan specifieke DNA-sequenties. Stimulatie van 3T3-fibroblasten met OFC-kristallen resulteert binnen enkele minuten in c-fos-expressie, die maximaal 30 minuten na stimulatie wordt bereikt. Inductie van c-myc-transcriptie door OFC-kristallen of PDGF vindt plaats binnen 1 uur en bereikt maximaal 3 uur na stimulatie. De cellen behouden een verhoogd niveau van c-fos- en c-myc-transcriptie gedurende ten minste 5 uur. In cellen met geïnactiveerd PCD wordt de stimulatie van c-fos en c-myc door OFC- of TFD-kristallen aanzienlijk onderdrukt, terwijl de inductie van deze genen door PDGF niet verandert.

Leden van de mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAP K)-familie zijn belangrijke regulatoren van verschillende intracellulaire signaalcascades. Eén subklasse van deze familie, p42/p44, reguleert celproliferatie via een mechanisme dat activering van de proto-oncogenen c-fos en c-jun omvat. OFC- en PFKD-kristallen activeren een proteïnekinase-signaalroute waarbij zowel p42 als p44 betrokken zijn, wat suggereert dat deze route een rol speelt in de door calciumbevattende kristallen geïnduceerde mitogenese.

Ten slotte is bij OFC-geïnduceerde mitogenese de transcriptiefactor Nuclear Factor κB (NF-κB) betrokken, die voor het eerst werd beschreven als het gen voor immunoglobuline κ light chain (IgK). Het is een induceerbare transcriptiefactor die belangrijk is in veel signaalroutes omdat het de expressie van verschillende genen reguleert. NF-κB-inductie gaat meestal gepaard met de afgifte van remmende eiwitten, IκB genaamd, uit het cytoplasma. NF-κB-inductie wordt gevolgd door translocatie van de actieve transcriptiefactor naar de celkern. OFC-kristallen induceren NF-κB in Balb/c- _3T3- fibroblasten en menselijke huidfibroblasten.

Verschillende pathways kunnen betrokken zijn bij de signaaltransductie na NF-κB-activering, maar alle omvatten proteïnekinasen die IκB fosforyleren (en dus afbreken). Op basis van in-vitrostudies werd eerder gedacht dat IκB diende als substraat voor kinasen (bijvoorbeeld PKC en proteïnekinase A). Recent is echter een IκB-kinasecomplex met een groot moleculair gewicht geïdentificeerd. Deze kinasen fosforyleren specifiek serineresiduen van IκB. NF-κB-activering door TNF-α en IL-1 vereist een efficiënte werking van NF-κB-inducerende kinase (NIK) en IκB-kinase. Het moleculaire mechanisme van NIK-activering is momenteel onbekend. Hoewel OFC-kristallen zowel PKC als NF-κB activeren, is de mate waarin deze twee processen mogelijk met elkaar verbonden zijn, onbekend. Omdat GκB-kinasemodificatie plaatsvindt via fosforylering, kan een rol van PKC bij de inductie van NF-κB door OFC-kristallen via fosforylering en activering van GκB-kinase niet worden uitgesloten. Dit concept wordt ondersteund door de remming van OFC-kristalgeïnduceerde mitogenese en NF-κB-expressie door de PKC-remmer staurosporine. Staurosporine kan eveneens GκB-kinase remmen en daarmee proteïnekinase A en andere proteïnekinasen.

Het mechanisme van OFC-kristal-geïnduceerde mitogenese in fibroblasten omvat dus minstens twee verschillende processen:

• een snelle membraangebonden gebeurtenis die resulteert in de activering van PKC en MAP K, inductie van NF-κB en proto-oncogenen,
• langzamere intracellulaire oplossing van kristallen, wat leidt tot een toename van het intracellulaire gehalte aan Ca ²⁺ en vervolgens tot de activering van een aantal calciumafhankelijke processen die de mitogenese stimuleren.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Inductie door MMP-calciumhoudende kristallen

De mediatoren van weefselschade door calciumbevattende kristallen zijn MMP's - collagenase-1, stromelysine, 92 kD gelatinase en collagenase-3.

Gezien het verband tussen de hoeveelheid OFC-kristallen en de vernietiging van gewrichtsweefsel, werd de hypothese geopperd dat OFC-kristallen en mogelijk sommige collagenen door synoviale cellen worden gefagocyteerd. Gestimuleerde synovocyten prolifereren en scheiden proteasen af. Deze hypothese werd in vitro getest door natuurlijke of synthetische OFC-, PFCD- en andere kristallen toe te voegen aan gekweekte humane of hondensynovocyten. De activiteit van neutrale proteasen en collagenasen nam dosisafhankelijk toe en was ongeveer 5-8 keer hoger dan die van de controlecelcultuur zonder kristallen.

In cellen gekweekt in een medium dat kristallen bevatte, werd co-inductie van collageenase-1, stromelysine en gelatinase-92 kDa mRNA gedetecteerd, gevolgd door secretie van enzymen in het medium.

OFC-kristallen zorgden ook voor de ophoping van collagenase-1 en collagenase-2 mRNA in volwassen varkenschondrocyten, gevolgd door secretie van de enzymen in het medium.

GM McCarty et al. (1998) bestudeerden de rol van intracellulaire kristaloplossing in kristalgeïnduceerde MMP-productie. Verhoging van de lysosomale pH met bafilomycine A remde de intracellulaire kristaloplossing en verzwakte tevens de proliferatieve respons van humane fibroblasten op OFC-kristallen, maar remde de MMP-synthese en -secretie niet.

Noch basisch calciumfosfaat, noch PFCD-kristallen induceerden de productie van IL-1 in vitro, maar natriumuraatkristallen deden dat wel.

Uit huidige gegevens blijkt duidelijk dat fibroblasten en chondrocyten de productie van MMP rechtstreeks stimuleren wanneer ze in contact komen met calciumhoudende kristallen.

Symptomen van artrose wijzen op een belangrijke rol van MMP in de progressie van de ziekte. De aanwezigheid van calciumhoudende kristallen bevordert de degeneratie van het weefsel van de aangetaste gewrichten.

Stimulatie van de prostaglandinesynthese

Naast de stimulatie van celgroei en de secretie van enzymen veroorzaken calciumhoudende kristallen de afgifte van prostaglandinen uit zoogdiercelculturen, met name PGE2 _. De afgifte van PGE2 vindt _in alle gevallen plaats binnen het eerste uur na blootstelling van cellen aan kristallen. R. Rothenberg (1987) stelde vast dat de belangrijkste bronnen van arachidonzuur voor de synthese van PGE2 fosfatidylcholine en fosfatidylethanolamine _zijn, en bevestigde tevens dat fosfolipase A2 en _NOX de dominante routes voor _{de productie} van PGE2 zijn.

PGE1 kan ook vrijkomen als reactie op OFA-kristallen. GM McCarty et al. (1993, 1994) bestudeerden de effecten van PGE2 _, PGE en het analoog misoprostol op de mitogene respons van menselijke fibroblasten op OFA-kristallen. Alle drie de middelen remden de mitogene respons op dosisafhankelijke wijze, waarbij PGE en misoprostol een meer uitgesproken remmende activiteit vertoonden. PGE2 en misoprostol, maar niet PGE2 _, remden de accumulatie van collageenase-mRNA als reactie op OFA-kristallen.

MG McCarty en H. Cheung (1994) onderzochten het mechanisme van OFC-gemedieerde activering van cellen door PGE. De auteurs toonden aan dat PGE, een krachtigere inductor van intracellulair cAMP dan PGE2 _, en PGE, OFC-geïnduceerde mitogenese en MMP-productie remt via een cAMP-afhankelijke signaaltransductieroute. Het is mogelijk dat de toename van de PGE-productie, geïnduceerd door OFC-kristallen, hun andere biologische effecten (mitogenese en MMP-productie) verzwakt via een feedbackmechanisme.

Kristalgeïnduceerde ontsteking

Calciumhoudende kristallen worden vaak aangetroffen in de synoviale vloeistof van patiënten met artrose. Episodes van acute ontsteking met leukocytose zijn echter zeldzaam, zowel bij artrose als bij kristalgeassocieerde artropathieën (bijvoorbeeld het Milwaukee-schoudersyndroom). Het flogistische potentieel van kristallen kan worden beïnvloed door een aantal remmende factoren. R. Terkeltaub et al. (1988) toonden aan dat bloedserum en plasma de reactie van neutrofiele granulocyten op basische calciumfosfaatkristallen significant kunnen remmen. De factoren die een dergelijke remming veroorzaken, zijn kristalbindende eiwitten. Een onderzoek naar een van deze eiwitten, een ₂ -HS-glycoproteïne (AHSr), toonde aan dat AHSP de krachtigste en meest specifieke remmer is van de reactie van neutrofiele granulocyten op OFC-kristallen. AHSr is een serumeiwit van leveroorsprong; het is bekend dat het, vergeleken met andere serumeiwitten, in relatief hoge concentraties wordt aangetroffen in bot- en mineraliserend weefsel. Bovendien is AHSr aanwezig in "niet-ontstoken" synoviaalvocht en is het ook aangetroffen op basische calciumfosfaatkristallen in natuurlijk synoviaalvocht. De mogelijkheid dat AHSr het flogogene potentieel van basische calciumfosfaatkristallen in vivo moduleert, kan dus niet worden uitgesloten.

Om al het bovenstaande samen te vatten, presenteren we twee schema’s van de pathogenese van osteoartritis, voorgesteld door WB van den Berg et al. (1999) en M. Carrabba et al. (1996), die mechanische, genetische en biochemische factoren combineren.